本文摘自和光純藥時(shí)報(bào) Vol.87 No.4（2019年10月號(hào)），由麻布大學(xué)獸醫(yī)學(xué)部 解剖第二研究室 小澤秋沙執(zhí)筆撰寫(xiě)。

本法是一種可使臨床檢查或研究中應(yīng)用廣泛的組織化學(xué)染色蘇木精-伊紅（HE）或Masson法（MT）染色的組織切片脫色，并可重新用于其他染色的方法。

迄今為止，每一種組織化學(xué)染色通常都需要使用至少一片組織切片，因此必須準(zhǔn)備與組織化學(xué)染色方法相對(duì)應(yīng)數(shù)量的組織切片。然而，由于制備組織切片時(shí)的技術(shù)熟練度以及組織樣品狀態(tài)、大小等原因，有時(shí)很難備齊多個(gè)適合評(píng)價(jià)的組織切片。另外，在評(píng)價(jià)同一細(xì)胞時(shí)一般使用連續(xù)切片的方法，然而即使獲得了合適的連續(xù)切片，想要觀察的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，也可能不同時(shí)存在于兩個(gè)相鄰的組織切片上。

在這種情況下，重復(fù)利用已有觀察特征的細(xì)胞或結(jié)構(gòu)的組織切片就會(huì)十分有用。HE染色可獲取組織大致特征，因此是*染色的代表染色法之一，如果可以對(duì)HE染色后的目標(biāo)結(jié)構(gòu)的組織切片進(jìn)行重新染色，便可以提高臨床檢查以及研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

至今為止，組織切片脫色通常使用乙醇與鹽酸的混合溶液、含有草酸、高錳酸鉀的溶液。然而，這些脫色方法都會(huì)影響組織切片在脫色后的再染色效果。

實(shí)際上，在乙醇中加入鹽酸的溶液不能對(duì)蘇木精等染料充分脫色。而通過(guò)高錳酸鉀、草酸脫色則會(huì)對(duì)組織切片造成很大的損害，重新染色時(shí)組織結(jié)構(gòu)可能會(huì)因?yàn)榍衅瑒冸x被破壞，從而限定了再染色的方法，也限制了組織切片的再利用。因此，學(xué)界期待開(kāi)發(fā)一種幾乎不會(huì)損害組織切片，并且可以對(duì)多種染色法進(jìn)行脫色后再染色的全新方法。

這次，F(xiàn)UJIFILM Wako開(kāi)發(fā)的deColorizing Solution，可以對(duì)HE染色后確認(rèn)了組織狀態(tài)（特定的結(jié)構(gòu)及細(xì)胞的存在）的切片脫色，再重新用于其他染色，從而能夠從同一組織切片中獲得更多信息。該方法的特點(diǎn)在于可以對(duì)原本難以脫色的蘇木精、鐵蘇木精進(jìn)行脫色。

使用方法：首先將染色后密封的載玻片標(biāo)本浸入二甲苯等有機(jī)溶劑中，直至蓋玻片自然剝落。請(qǐng)注意，在此過(guò)程中若是強(qiáng)行分離蓋玻片可能會(huì)破壞組織切片。

另外，若在組織切片上仍然殘留有封固劑的狀態(tài)下就進(jìn)行下一步驟，水溶性色素在水合后不會(huì)脫落，會(huì)降低隨后使用deColorizing Solution進(jìn)行脫色的效果，因此必須使用二甲苯等有機(jī)溶劑充分浸泡。必須注意的是，標(biāo)本越舊，封固劑的固化越牢固，封固劑就越難去除。

其次，將組織切片依次用各種濃度的乙醇進(jìn)行水合，后浸入蒸餾水中。在水合過(guò)程中，伊紅等水溶性色素基本脫色，組織切片上僅殘留染色的蘇木精。將殘留蘇木精染色的組織切片浸入按照使用濃度稀釋的deColorizing Solution 1中。脫色主要取決于組織切片染色后保存的時(shí)長(zhǎng)，但蘇木精在室溫下于deColorizing Solution 1中浸漬1 h基本就能脫色。

鐵蘇木精脫色時(shí)需要在deColorizing Solution 1中浸漬1 h后使用蒸餾水清洗3次，然后浸漬于deColorizing Solution 2。通過(guò)光學(xué)顯微鏡確認(rèn)脫色程度（染色殘留情況），確認(rèn)不會(huì)影響下次染色后，浸漬于蒸餾水并清洗3次，這時(shí)可用于重新染色。

目前，在使用deColorizing Solution脫色后，可以使用的再染色方法已確認(rèn)的有HE染色、PAS染色、MT染色和免疫組織化學(xué)染色。

圖1和圖2分別是小鼠海馬體以及肝臟在HE染色后使用deColorizing Solution按照上述步驟脫色后的圖片。如圖１A及圖２A所見(jiàn)，包括細(xì)胞核在內(nèi)，被蘇木精染色的部分在圖1B及圖2B中大部分已被脫色。

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                                   圖1.  使用deColorizing Solution 1脫色HE 染色后的組織切片并重新染色

                                   A：HE染色的小鼠海馬體組織圖像

                                   B：使用deColorizing Solution 1脫色后與A相同位置的組織圖像

                                   C：脫色后使用抗Iba1抗體進(jìn)行熒光免疫組織化學(xué)染色后與A和B相同位置的組織圖像

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                                   圖2. 使用deColorizing Solution 1脫色HE 染色后的組織切片并重新染色

                                   A：HE染色的小鼠肝臟組織圖像

                                   B：使用deColorizing Solution 1脫色后與A相同位置的組織圖像

                                   C：脫色后使用抗PCNA抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后與A和B相同位置的組織圖像

另外，圖3為小鼠肝臟以及腎臟在MT染色后使用deColorizing Solution 1和2脫色后的圖像。圖3A和C中包括細(xì)胞核在內(nèi)，被鐵蘇木精染色的大部分在圖3B和D中均已*脫色。

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                                   圖3. 使用deColorizing Solution 1和2對(duì)MT 染色后的組織切片脫色

                                   A：MT染色后的小鼠肝臟組織圖像

                                   B：使用deColorizing Solution 1和2脫色后與A相同位置的組織圖像

                                   C：MT染色后的小鼠腎臟的組織圖像

                                   D：使用deColorizing Solution 1和2脫色后與C相同位置的組織圖像

圖1C為小鼠海馬體脫色后使用抗Iba1抗體（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的圖片，圖1A和B為同一位置的圖像。如圖可見(jiàn)，脫色后的海馬體切片仍然可以檢測(cè)出Iba1陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞突起。圖2C為小鼠肝臟脫色后使用抗PCNA抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的圖片。如圖可見(jiàn)，陽(yáng)性PCNA主要在肝細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。

另外，并未發(fā)現(xiàn)因脫色導(dǎo)致的組織切片破壞等損傷。

該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，大量長(zhǎng)期保存在大學(xué)、研究所、醫(yī)院等的*組織切片，在制備時(shí)沒(méi)有新型染色方法以及針對(duì)新型抗原的抗體，通過(guò)再染色等方法可以重新評(píng)價(jià)以獲取新的實(shí)驗(yàn)信息。

目前，deColorizing Solution的應(yīng)用只適用于HE 染色和MT 染色后的脫色，但隨著該方法的應(yīng)用范圍拓展，脫色法在重復(fù)使用組織切片方面的實(shí)用性將進(jìn)一步提高。

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