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高純度質粒小量快速提取試劑盒操作步驟

來源:上海研謹生物科技有限公司   2021年04月06日 11:07  

高純度質粒小量快速提取試劑盒

HighPure Rapid Mini Plasmid Kit

 保存條件:本試劑盒在室溫儲存 18 個月不影響使用效果。

產品介紹:

本試劑盒采用改進 SDS-堿裂解法裂解細胞,離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH 值狀態(tài)下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA,再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除,最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。

產品特點:

1.離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口特制吸附膜,柱與柱之間吸附量差異極小,可重復性好??朔藝a試劑盒膜質量不穩(wěn)定的弊端。

2.*的去蛋白液配方,可以高效去除殘留的核酸酶,即使是核酸酶含量豐富的菌株如 JM 系列、HB101 也可以輕松去除。有效防止了質粒被核酸酶降解。

3.快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯_*仿等試劑,也不需要乙醇沉淀。獲得的質粒產量高、純度好, 可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。

注意事項:

1.第-次使用時,將試劑盒所帶的全部 RNase A 加入溶液 P1 后(終濃度 100ug/ml) 置于 2-8℃保存。如果溶液 P1 中 RNase A 失活,提取的質??赡軙形⒘?RNA 殘留,在溶液 P1 中補加 RNase A 即可。

2.環(huán)境溫度低時溶液 P2 中 SDS 可能會析出渾濁或者沉淀,可在 37℃水浴加熱幾 min, 即可恢復澄清,不要劇烈搖晃,以免形成過量的泡沫。

3.避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發(fā)、氧化、pH 值變化。

4.溶液 P3 和去蛋白液 PE 中含有刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套,避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時,要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5.提取質粒的量與細菌培養(yǎng)濃度、質??截悢?shù)等因素有關。一般高拷貝質粒,建議接種單菌落于 1.5-4.5ml 加合適抗生素的 LB 培養(yǎng)基, 過夜培養(yǎng) 14-16 個小時,可提取出多達 20µg 的純凈質粒。如果所提質粒為低拷貝質?;虼笥?10kb 的大質粒,應適當加大菌體使用量,使用 5-10ml 過夜培養(yǎng)物,同時按比例增加 P1、P2、P3 的用量,其它步驟相同。

6.得到的質粒 DNA 可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260 值為 1 相當于大約 50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶,也可能為 2 條或者多條 DNA 條帶,這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成,與提取物培養(yǎng)時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本超螺旋可以超過 90%。

7.洗脫液 EB 不含有螯合劑 EDTA,不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫, 但應該確保 pH 大于 7.5,pH 過低影響洗脫效率。用水洗脫質粒應該保存在-20℃。質粒DNA 如果需要長期保存,可以用 TE 緩沖液洗脫(10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH 8.0),但是 EDTA 可能影響下游酶切反應,使用時可以適當稀釋。

自備試劑:無水乙醇

操作步驟:

提示:

? 第-次使用前請先在漂洗液 WB 和去蛋白液 PE 瓶中加入指*-定量無水乙醇,充分混勻,加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇,以免多次加入!將 RNase A 全部加入溶液 P1 中,混勻,每次使用后置于 2-8℃保存。將溶液 P3 放在冰上預冷,可以提高產量。

1.向吸附柱AC 中(吸附柱放入收集管中)加 500μl 的平衡液BL,12,000rpm  離心 1 min,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。

2.取 1.5-4.5ml 過夜培養(yǎng)的菌液,12,000rpm 離心 30 sec,盡可能的倒干上清,收集菌體。收集超過 1.5 ml 菌液, 可以離心棄上清后,在同一個 1.5ml 管內加入更多的菌液,重復步驟 1,直到收集到足夠的菌體。

3.用 250μl 溶液 P1 重懸菌體沉淀,渦旋振蕩至*懸浮。

4.加 250μl 的溶液 P2,溫和地上下翻轉 4 -7 次使菌體充分裂解。

5.加 350μl 溶液 P3,立即溫和地上下翻轉 4 -7 次,充分混勻時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀,

13,000rpm 離心 10 min,小心取上清。加入溶液 P3 后應該立即混勻,以免產生 SDS

的局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀,可再次離心后取上清

6.將上一步所得上清加入吸附柱 AC 中(吸附柱放入收集管中),12,000rpm 離心 30-60

sec,倒掉收集管中的廢液可選步驟:加入 500μl 去蛋白液 PE,12,000rpm 離心 30-60

sec,棄廢液。此步驟為了去除痕量核酸酶等雜質,如所用菌株為 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株,核酸酶含量豐富,應加此步驟;如所用菌株為 XL-1 Blue 和 DH5α等缺陷型菌株,核酸酶含量低,則可略過此步驟。

7.加入 500μl 漂洗液 WB(請先檢查是否已加入無水乙醇!),12,000rpm  離心 30 sec,棄掉廢液。

8.重復步驟 7。

9.將吸附柱 AC 放回空收集管中,12,000rpm 離心 2 min,盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

10.取出吸附柱 AC,放入一個干凈的離心管中,室溫放置幾分鐘。

11.在吸附膜的中間部位加 50μl-100μl 洗脫緩沖液 EB(洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好),室溫放置 2 min,12,000rpm  離心 1 min。如果需要較多量質粒,

可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中,離心 1 min。洗脫體積越大,洗脫效率越高。如果需要質粒濃度較高,可以適當減少洗脫體積, 但是最小體積不應少于 50μl, 體積過小降低質粒洗脫效率,減少質粒產量。若用ddH2O 做洗脫液,應保證其 pH 值在 7.0-8.5 范圍內,pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。

實驗代做服務:

 

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