產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物學特性與檢驗方法！

一、行病學

產(chǎn)氣莢膜梭菌為厭氧芽胞菌，是引起食源性胃腸炎見的病原之一?？梢鸬湫偷氖澄镏卸?、爆發(fā)。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病為魏氏梭菌中毒?；颊吲R床特征是劇烈腹絞痛和腹瀉。攝食被本菌污染的食品后8�22小時開始發(fā)病。在食品中該菌數(shù)量必須達到很高時（1.0×107或更多），才能在腸道中生產(chǎn)毒素，病程通常在24小時內(nèi)，但某些個體的不顯著癥狀可能會持續(xù)1�2周，已報導有少數(shù)病人因脫水和其它混合感染而導致死亡。

據(jù)美國人類衛(wèi)生教育福利部報導魏氏梭菌引起的食物中毒，在美國占細菌性食物中毒的30%左右，另據(jù)美國疾病控制中心，估計每年因產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒約近1萬人，其中大約只報導1200例，暴發(fā)約20起，大量的暴發(fā)和少量的發(fā)病都與公共飲食有關(guān)。例如：學校的自助食堂和護理病房，產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒發(fā)生于兒童和老人。

產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于環(huán)境中，經(jīng)常在人和許多家養(yǎng)及野生動物的腸道中發(fā)現(xiàn)該細菌的芽胞長期存在于土壤和沉淀物中，從牛肉、豬肉、羔羊、雞、火雞、燜肉、紅燒蔬菜，燉肉和肉汁中分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉類和魚類食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因為食品加熱不*，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加溫不夠或后污染而在緩慢的冷卻過程中，細菌繁殖體大量繁殖并形成芽胞產(chǎn)生腸毒素，其食品并不一定在色味上發(fā)現(xiàn)明顯的變化，人們在誤食了這樣的熟肉或湯菜，就有可能發(fā)病。

產(chǎn)氣莢膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的熱抵抗力很強，由患者糞便中分離的芽胞能耐受100℃,1�5小時的加熱。除了具有形成芽胞及耐熱等特點之外，生化性狀，毒素及酶的特異性等，同其它魏氏梭菌是一致的。

當產(chǎn)品達到合適溫度時，那些未被殺死的芽胞，由于蒸煮而使其可能發(fā)芽。蒸煮后需要經(jīng)過快速一致的冷卻。事實上在所有暴發(fā)的病例中，產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒的主要原因是沒有經(jīng)過恰當冷卻事先煮好的食品，特別當做好的食品量又是很大時，適當?shù)臒崽幚恚?0℃以上）充分的再加熱，冷卻食品（中心溫度為24℃）也是必要的控制措施，培訓食品加工人員，仍是控制措施的一個關(guān)鍵方面。

二、生物學特性

1、形態(tài)

本菌菌體兩端鈍圓，直桿狀1-2×2-10μm，革蘭氏陽性，卵圓形芽胞位于菌體或近端，不比菌體明顯膨大，但有些菌株在一般的培養(yǎng)條件下很難形成芽胞，無鞭毛，在人和動物活體組織內(nèi)或在含血清的培養(yǎng)基內(nèi)生長時有可能形成莢膜。

2、培養(yǎng)

本菌雖屬厭氧性細菌，但對厭氧程度的要求并不太嚴，甚至在EH=200-250mv的環(huán)境內(nèi)也能生長。

在普通培養(yǎng)基上能生長，若加葡萄糖，血液，則生長更好。生長適宜溫度為37-47℃，多認為43-47℃為最宜本菌生長和繁殖速度極快，在適宜條件下增代時間僅8min，可利用高溫快速培養(yǎng)法，對本菌進行選擇分離，如在45℃下，每培養(yǎng)3-4小時傳種1次，即可較易獲得純培養(yǎng)，在深層葡萄糖瓊脂中大量產(chǎn)氣，致使瓊脂破碎，在牛奶培養(yǎng)基中，可見到暴裂發(fā)酵，在庖肉培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)小時即可見到生長，產(chǎn)生大量氣體，肉渣或肉塊變?yōu)槁詭Х凵?，但不被消化?/span>

在普通瓊脂平板上培養(yǎng)15小時左右可見到菌落，培養(yǎng)24小時菌落直徑2�4mm，呈凸面狀，表面光滑半透明，正圓形，在營養(yǎng)成分不足或瓊脂濃度高的平板上，有時尤其經(jīng)過傳種的菌株，可能形成鋸齒狀邊緣或帶放射狀條紋的R型菌落。

在含人血、兔血或綿羊血的瓊脂平板上培養(yǎng)的菌落周圍有雙層溶血環(huán)，內(nèi)層溶血*，外層溶血不*，好似靶狀。

在乳糖、牛奶、卵黃瓊脂平板上培養(yǎng)的菌落周圍出現(xiàn)乳光渾濁帶。此反應(yīng)能被本菌α抗毒素抑制。由于發(fā)酵乳糖菌落周圍的培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化（中性紅指示劑呈粉紅色）不消化牛奶，不分解游離脂肪，菌落周圍不出現(xiàn)透明環(huán)及虹彩層。

3、生化特性

所有菌株均發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖及蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，液化明膠，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，但也有例外。能將亞硫酸鹽還原為硫化物。在含亞硫酸鹽及鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落。發(fā)酵牛奶中的乳糖、牛奶酸凝固，同時由于大量產(chǎn)氣凝塊碎裂，所謂暴力發(fā)酵，這是本菌的主要生化特征之一，也是主要鑒別的指標。G+C克分子百分比為24-27%。

4、毒素

(1)外毒素：各型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的外毒素(或可溶血抗原)共有12種,其中主要有4型,即A、B、C、D.而已知〝A型〞毒素與人類食物中毒有關(guān)。

(2)腸毒素：A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐熱株能引起人的食物中毒,關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌食物中毒的發(fā)病機制,基本認為是,被耐熱性A型產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞污染的肉、禽等生食品,雖經(jīng)烹制加熱,但芽胞不僅不死滅,反而由于受到〝熱刺激〞,在較高溫度長時間儲存(即緩時冷卻)的過程中芽胞發(fā)芽,生長,繁殖,而且隨食物進入人腸道的這些繁殖體容易再形成芽胞,同時產(chǎn)生腸毒素,聚集于芽胞內(nèi),當菌體細胞自溶和芽胞游離時，腸毒素將被釋放出來,人、猴、狗等口服人工提取的該腸毒素能引起腹瀉。

人和動物對產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素的免疫主要表現(xiàn)為抗腸毒素的產(chǎn)生,健康者血清常含有抗腸毒素,似乎表明產(chǎn)氣莢膜梭菌作為正常菌群,在腸道內(nèi)可能在不斷地產(chǎn)生著腸毒素。

三、檢驗方法

1、樣品的儲存和運送

如樣品不能立即進行檢驗時,應(yīng)在樣品中加等量緩沖甘油--氯化鈉溶液(液體食品應(yīng)加雙料的),將樣品做低溫保存,直到檢驗,運送樣品時,應(yīng)使樣品保持冷凍狀態(tài),并要避免容器消損。

2、將解凍樣品取25g移入滅菌的均質(zhì)杯,并加入0.1%蛋白胨水225mL,低速攪拌1-2分鐘,使之均質(zhì)化,作為1:10稀釋液,以上1:10稀釋的均質(zhì)液,按1mL加入0.1%蛋白胨水9mL,作做成10-2--10-6的系列稀釋液,(如為液體樣品則可吸取25mL加入盛有225mL稀釋劑的500mL稀釋并搖勻,再作10倍遞增稀釋即可)。

傾注不含卵黃的TSC瓊脂倒10個滅菌平皿中,每皿約5mL,并迅速旋轉(zhuǎn)平皿,使瓊脂凝固后,將每個平皿編號標記,以無菌操作,吸取稀釋樣品1mL分別加到每個瓊脂平板表面中心,再向平皿傾注不含卵黃的TSC瓊脂15mL,緩慢地旋轉(zhuǎn)平皿,使其與接種物混合均勻.也可用滅菌L棒,將0.1mL樣品稀釋液均勻地涂布于不含卵黃乳液的TSC瓊脂上,將平板水平靜置5-10分鐘,使接種物被吸收,然后用不含卵黃的TSC瓊脂10mL覆蓋平板表層,瓊脂凝固后,將平板置于厭氧罐內(nèi)于36+1℃,培養(yǎng)20小時,取出平板,用肉眼觀察生長情況和有無黑色菌落,挑選有20-200個黑色菌落的平板進行記數(shù)，產(chǎn)氣莢膜梭菌的菌落一般呈黑色。

3、證實

從可記數(shù)的平板(具20-200個菌落)中挑選10個典型菌落,分別接種到液體硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基試管中,于36±1℃,培養(yǎng)18-24小時,取培養(yǎng)物涂片,作革蘭氏染色鏡檢,檢查培養(yǎng)物的純度和細菌形態(tài),產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性,粗短的梭狀芽胞桿菌.對于被污染的培養(yǎng)物可劃線接種在含有卵黃的TSC瓊脂平板上,于厭氧條件下以36±1℃,24小時培養(yǎng),以獲得純培養(yǎng)物。

上述培養(yǎng)物,以接種針穿刺接種動力,硝酸鹽培養(yǎng)基36±1℃厭氧培養(yǎng)24小時觀察有無動力,滴加甲萘胺液和對氨基苯磺酸液各0.5mL,觀察硝酸鹽是否被還原,取生長旺盛的硫乙醇酸鈉培養(yǎng)液1mL接種含鐵牛奶培養(yǎng)基,厭氧培養(yǎng)過夜或46℃2-5小時觀察有無暴烈發(fā)酵現(xiàn)象,但培養(yǎng)基不變黑,將培養(yǎng)液點種卵黃瓊脂平板(每個平板至少可點種10點),倒置厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi)36±1℃培養(yǎng)24小時,觀察接種點,產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶,分解卵黃中的卵磷脂,使接種點的底部及周圍形成乳白色的渾濁帶.此外還可作明膠液化及含1%水楊甙和含1%棉子糖的發(fā)酵試驗等,對上述四項主要生化試驗,全部符合者即可確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

4、結(jié)果解釋及報告

樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的計算,基于被證實為產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落的百分數(shù)(例如10‐4稀釋的平板中,平均有85個菌落,10個菌落中,有8個被證實為產(chǎn)氣莢膜梭菌,那么每1g食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)即為85×(8/10)×10000=680000),報告產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌數(shù)/g(mL) 。

                          產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗檢測程序

                                    ↓

                         檢樣25g(mL)或稀釋液225mL

                                   ↓

                            TSC瓊脂混合傾注

                                   ↓

                             黑色菌落記數(shù)

                                  ↓

                     任挑黑色菌落10個,分別接種FT培養(yǎng)基

                                  ↓

                               確證試驗

                                  ↓

                            鏡 動 銷 牛 卵

                            檢 力 酸 奶 磷

                            形 試 鹽 發(fā) 脂

                            態(tài) 驗 還 酵 分

　　                           原　　解

                                 ↓

                               菌落計數(shù)

四、培養(yǎng)過程中芽胞形成和腸毒素的產(chǎn)生

假如對分離的菌株,直接測試芽胞和腸毒素,應(yīng)在硫乙醇酸鹽肉湯中繼續(xù)培養(yǎng),如上述,將儲存培養(yǎng)物移至其它實驗室作測試時,必須先將其移種至Difco公司生產(chǎn)的熟肉培養(yǎng)基中,并于35℃培養(yǎng)24小時,然后再置于室溫中24小時,并將此熟肉培養(yǎng)物放置在4℃保存。

用旋轉(zhuǎn)混合熟肉培養(yǎng)物,并分別各移種0.5mL至2支含10mL新鮮經(jīng)殺菌的液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中,將其中1管置于有水的燒杯中,或在水浴中加熱75℃10分鐘,于35℃培養(yǎng)18小時,另外1管在35℃培養(yǎng)4小時,并將此培養(yǎng)物接種改良AE芽胞形成培養(yǎng)基中,用0.75mL經(jīng)4小時培養(yǎng)的硫乙醇酸鹽的培養(yǎng)基,接種到芽胞肉湯中,于35℃厭氧罐中,培養(yǎng)18-24小時。

核對培養(yǎng)結(jié)果,用相差顯微鏡觀察芽胞或作涂片染色鏡檢,顯微鏡視野中少于5個芽胞的認為芽胞形成不良。

將芽胞形成培養(yǎng)物用10000×g轉(zhuǎn)速15分鐘離心,并將無細胞的芽胞培養(yǎng)物,以反向乳凝試劑盒,檢測腸毒素。

五、控制

適宜的冷卻處理和再加熱，食品加工人員的教育。 當產(chǎn)品達到合適溫度時，那些未被殺死的芽胞可能發(fā)芽。蒸煮后需要經(jīng)過快速統(tǒng)一的冷卻，事實上在所有的爆發(fā)病例中，產(chǎn)氣莢膜梭菌中毒的主要原因是沒有經(jīng)過恰當冷卻事先煮好的食品，特別當食品量又是很大時。適當?shù)臒崽幚?，充分的再加熱，冷卻食品，也是必要的控制措施。食品加工人員的教育仍是控制的一個關(guān)鍵方面。

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