鏡質(zhì)合璧  還原真實(shí)

成像質(zhì)譜顯微鏡用于米曲中磷脂和葡萄糖的可視化分析

引言

米曲是清酒釀造中的關(guān)鍵元素。它在清酒釀造中的主要作用被認(rèn)為是提供分解淀粉和蛋白質(zhì)的消化酶。米曲成品的成分對(duì)清酒的品質(zhì)（味道和香氣）有很大的影響。然而，目前為止對(duì)米曲質(zhì)量的評(píng)估經(jīng)常依賴于釀酒師的經(jīng)驗(yàn)。這意味著此領(lǐng)域相關(guān)科學(xué)知識(shí)的不足，且仍有發(fā)展空間。當(dāng)釀酒師評(píng)估米曲質(zhì)量時(shí)，米曲的物理結(jié)構(gòu)，即外觀和質(zhì)地似乎是質(zhì)量指標(biāo)之一。 

在過(guò)去的研究中利用掃描電子顯微鏡來(lái)研究米曲的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但直到近幾年，評(píng)估米曲結(jié)構(gòu)和成分關(guān)系的研究仍然進(jìn)展甚微。由于島津iMScope成像質(zhì)譜顯微鏡可同時(shí)觀察樣品結(jié)構(gòu)和成分分布，在本應(yīng)用報(bào)告中，我們將iMScope應(yīng)用于發(fā)酵領(lǐng)域，并嘗試可視化分析米曲結(jié)構(gòu)和成分分布。

如圖1所示，質(zhì)譜成像（MSI）是非常適合觀察米曲結(jié)構(gòu)以及決定其有效成分分布的技術(shù)。MSI應(yīng)用于食品的論文，已有蘆筍中天冬酰胺和姜黃根中姜黃素分布可視化的應(yīng)用報(bào)告⑴,⑵。本文針對(duì)食品科學(xué)研究中的“發(fā)酵”新應(yīng)用領(lǐng)域，嘗試著將米曲內(nèi)的結(jié)構(gòu)和成分分布可視化。由于米曲非常易碎，在進(jìn)行MSI分析時(shí)，未經(jīng)前處理制作米曲切片幾乎是不可能的。因此，我們研究了各種切片制備方法，并成功實(shí)現(xiàn)從生米到蒸米和米曲過(guò)程中的代謝物可視化分析。

圖1 質(zhì)譜成像（MSI）工作流程

實(shí)驗(yàn)

2-1試劑

使用羧甲基纖維素（CMC）（FUJIFILM Wako）為包埋劑，配制濃度為4%的CMC水溶液，并將溶液放入70℃的恒溫箱過(guò)夜來(lái)確保*溶解。本實(shí)驗(yàn)中使用的基質(zhì)是α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）和N-(1-萘基)聚乙烯二胺二鹽酸鹽（NEDC）（Merck），溶劑為乙腈、異丙醇和甲醇（FUJIFILM Wako）、超純水。

2-2切片制備

使用清酒釀造用的拋光率為70%的山田錦大米（白鶴酒造株式會(huì)社）制成的蒸米和米曲。生米可視化研究中使用市售大米。如前所述，這些樣品材料極其脆弱。因此，采用冷凍切片機(jī)制備切片并使用粘性冷凍膜（cryo-lab）回收獲得的切片。將米粒包埋在上文所述的4%羧甲基纖維素溶液中，在-80℃冷凍。切片厚度為20 μm，獲得的薄膜利用導(dǎo)電雙面膠帶（3M公司）固定在ITO涂層玻璃載玻片上（無(wú)MAS涂層，表面電阻：100 Ω/m2）（松浪玻璃工業(yè)株式會(huì)社）（圖2）。

圖2 米曲切片制備

2-3基質(zhì)涂敷

在檢測(cè)米粒切片和米曲切片中的磷脂時(shí)，使用島津iMLayer基質(zhì)升華系統(tǒng)將CHCA沉積在樣品表面（圖3），接著噴涂CHCA溶液(3)。基質(zhì)升華的膜厚度為0.5 μm。利用由乙腈、異丙醇、超純水（3: 1: 6）構(gòu)成的含0.1 %甲酸的混合溶劑溶解CHCA，調(diào)節(jié)其濃度為10 mg/mL。已知可以有效電離葡萄糖的基質(zhì)NEDC，利用iMLayer進(jìn)行升華，升華時(shí)設(shè)置溫度為220℃、時(shí)間為10分鐘。NEDC基質(zhì)升華后，利用5%甲醇溶液進(jìn)一步進(jìn)行重結(jié)晶。

圖3  iMLayer基質(zhì)升華系統(tǒng)

2-4質(zhì)譜成像

MSI檢測(cè)使用島津iMScope成像質(zhì)譜顯微鏡進(jìn)行。激光照射次數(shù)為100次/點(diǎn)。正離子模式檢測(cè)磷脂，空間分辨率為25 μm，負(fù)離子模式檢測(cè)葡萄糖，空間分辨率為50 μm。檢測(cè)范圍：正離子模式m/z　400-800，負(fù)離子模式m/z 180-230。在所有檢測(cè)中，激光強(qiáng)度均設(shè)置為45，檢測(cè)器電壓為2.1 kV。

2-5構(gòu)建MS圖

數(shù)據(jù)分析和MS圖像構(gòu)建采用島津MSI分析軟件Imaging MS Solution和IMAGEREVEAL MS進(jìn)行。IMAGEREVEAL MS是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)功能實(shí)現(xiàn)非靶向分析的軟件。它擁有校正函數(shù)（圖像過(guò)濾、像素插值），并含有“相似圖片提取”功能。本文后半部分所示的葡萄糖可視化數(shù)據(jù)是利用IMAGEREVEAL MS軟件進(jìn)行分析。

結(jié)果

3-1生米、蒸米和米曲中磷脂的分布

圖4顯示了生米、蒸米和米曲切片中膽堿的分布。膽堿是一種在米曲制作過(guò)程中分布和數(shù)量會(huì)發(fā)生巨大變化的典型成分。生米的結(jié)果在碾米之前測(cè)得，且結(jié)果表明膽堿累積在大米胚芽中。在碾碎后的蒸米中，來(lái)自膽堿的峰急劇下降，但在米曲的內(nèi)部則觀察到較強(qiáng)的峰。這表明膽堿在米曲發(fā)酵過(guò)程（即米曲制作過(guò)程）形成。因此，使用MSI 可以觀察到米曲制作過(guò)程中膽堿數(shù)量和空間分布發(fā)生急劇變化的現(xiàn)象。

圖4 生米、蒸米和米曲中膽堿的分布

在米曲的內(nèi)部還觀察到各種磷脂（包括溶血磷脂）的累積（圖5）。尤其是溶血磷脂酰膽堿LPC（16:0），m/z 496.34和LPC（18:2），m/z 520.34顯示這一趨勢(shì)(4)。而磷脂m/z 748.35和786.30的MS圖像顯示出其在米曲中的不均勻分布。這種異質(zhì)性被認(rèn)為由曲霉（米曲霉，Aspergillus oryzae）侵入蒸米中生長(zhǎng)出霧狀菌絲導(dǎo)致，這個(gè)過(guò)程就被稱為“hazekomi”。下一部分我們將介紹一種將hazekomi過(guò)程可視化的方法開發(fā)以及將這種方法與MSI結(jié)合使用的結(jié)果。

圖5 米曲（山田錦，稻米拋光率：70 %）中溶血磷脂和磷脂的分布

3-2hazekomi可視化及其與MSI的配合使用⑸,⑹

haze指的是米曲霉菌絲在蒸米表面擴(kuò)散時(shí)呈現(xiàn)的白點(diǎn)，在釀酒師進(jìn)行米曲目檢時(shí)被作為一個(gè)結(jié)果指標(biāo)。在早期的hazekomi可視化研究中，Yoshii等人發(fā)表了一篇基于掃描電子顯微鏡（SEM）觀察的報(bào)告，他們通過(guò)將米曲霉傳播過(guò)程直接可視化的方式成功觀察到了米曲中米曲霉的生長(zhǎng)，該結(jié)果有助于改善制曲過(guò)程（7）。

利用SEM將hazekomi過(guò)程可視化時(shí)，觀察微觀區(qū)域的能力是一個(gè)重要特征。不過(guò)，我們認(rèn)為將整個(gè)米曲hazekomi過(guò)程可視化的方法以及可獲取成分分布信息的技術(shù)也是有用的。為了解決這一問(wèn)題，我們引入了采用β-葡萄糖醛酸酶（GUS）作為標(biāo)志基因的GUS報(bào)告系統(tǒng)用于hazekomi可視化。具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)構(gòu)建米曲霉GUS表達(dá)株以及生產(chǎn)使用該菌株的米曲（以下稱為GUS米曲）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)制曲過(guò)程中米曲霉生長(zhǎng)的清晰觀察。GUS米曲的使用實(shí)現(xiàn)了通過(guò)顏色反應(yīng)來(lái)可視化米曲霉位置，而當(dāng)這種技術(shù)和MSI配合使用時(shí)，可獲取關(guān)于成分分布的信息。這兩種技術(shù)的結(jié)合同時(shí)實(shí)現(xiàn)了整個(gè)米曲的hazekomi可視化以及成分分布的可視化研究。

在此我們將對(duì)這種旨在把GUS報(bào)告基因系統(tǒng)應(yīng)用于米曲的創(chuàng)新研究進(jìn)行闡述。GUS報(bào)告基因系統(tǒng)最初是為了將植物組織中菌絲體的可視化而開發(fā)的。在植物組織中，常見做法是將樣品浸泡在5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）溶液中，這是一種用于著色的顯色底物。擁有極硬細(xì)胞壁的植物組織即便是長(zhǎng)期浸泡在X-Gluc溶液中，也能夠毫無(wú)問(wèn)題地維持樣品觀察所需的形態(tài)。

不過(guò)，如前所述，米曲非常脆弱，且其性狀和植物組織*不同。這意味著采用現(xiàn)有的著色方案將極為困難。事實(shí)上，我們證實(shí)了在米曲浸泡在X-Gluc溶液中固定著色所需時(shí)間內(nèi)，樣品的形態(tài)由于吸水而發(fā)生了很大的改變。為了避免這一問(wèn)題，必須改變添加X-Gluc的方式。因此，我們構(gòu)思了一種通過(guò)將X-Gluc溶液噴灑在GUS米曲切片上的方法來(lái)可視化分析hazekomi過(guò)程。

圖6顯示了采用這種方法得到的結(jié)果。這里制曲使用的是拋光率為70%的拋光白鶴錦稻米（白鶴酒造株式會(huì)社的酒米），并在制曲開始24h、31h以及43h后取樣。隨著制曲的進(jìn)行，可以觀察到靛藍(lán)色從曲的表面滲透到內(nèi)部。尤其是在43小時(shí)之后、制曲完成時(shí)，不僅在曲的表面，在內(nèi)部也能檢測(cè)到濃烈的靛藍(lán)色，表明米曲霉已經(jīng)到達(dá)了稻米內(nèi)部。

曲的一個(gè)主要作用是在釀造（發(fā)酵）階段提供各種酶，以便形成酵母菌所需的營(yíng)養(yǎng)。觀察到的主要酶為α-淀粉酶或葡萄糖淀粉酶，這兩者會(huì)形成作為酵母生長(zhǎng)所需的葡萄糖。此外，也有報(bào)道表示α-淀粉酶可能是影響曲霉菌絲體侵入性生長(zhǎng)的非常重要的酶。

圖6 GUS米曲中hazekomi過(guò)程的可視化分析（比例尺：1 mm（插入圖片：200 μm））

盡管既往研究中報(bào)道了制曲后葡萄糖的增加，但hazekomi和葡萄糖分布之間的關(guān)系尚未明確。在制曲過(guò)程每個(gè)階段的米曲質(zhì)譜圖中，確實(shí)觀察到了葡萄糖峰強(qiáng)度的升高（圖7）。已有報(bào)道表明NEDC可以增加癌組織中葡萄糖檢測(cè)的靈敏度（8）。因此，當(dāng)使用NEDC作為葡萄糖MSI的基質(zhì)時(shí)，[M+Cl]-= m/z 215.02在負(fù)離子模式下被檢測(cè)到。

為了研究GUS米曲的hazekomi過(guò)程和葡萄糖分布之間的關(guān)系，使用GUS染色切片相鄰的切片進(jìn)行了MSI，比較獲得的葡萄糖離子強(qiáng)度和GUS染色圖像的分布，圖8顯示其結(jié)果。

觀察葡萄糖分布及與GUS染色圖像的疊加可以了解到從制曲初始階段到后期階段，葡萄糖從外到內(nèi)增加。這一結(jié)果表明hazekomi和葡萄糖分布之間存在相關(guān)性。

另外，有些區(qū)域由于X-Gluc為深色且葡萄糖強(qiáng)度很高而成像為藍(lán)色（黑色箭頭顯示），同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中也能看到有些部分雖然也觀察到了hazekomi，但葡萄糖強(qiáng)度低，例如以黑色圓圈表示的區(qū)域。這些結(jié)果表明位置不同，hazekomi產(chǎn)生的葡萄糖量存在差異性。今后，可以通過(guò)包含各種代謝物（例如氨基酸、糖類、糖醇）分析的探討來(lái)實(shí)現(xiàn)從化學(xué)角度更好地了解hazekomi現(xiàn)象。

雖然目前的考察著重于葡萄糖并解釋了伴隨hazekomi過(guò)程葡萄糖分布的變化，但可以想象，形成的酶的擴(kuò)散范圍和活性也會(huì)受到諸如米粒特征等其他因素的影響。這種新的可視化技術(shù)（GUS米曲和MSI的融合）預(yù)期可以改進(jìn)米曲和其他曲衍生產(chǎn)品的制曲流程。

圖7 利用NEDC基質(zhì)獲得的葡萄糖峰的時(shí)間依賴性變化

圖8 GUS米曲中葡萄糖（[M + Cl]–）的可視化（比例尺：1 mm）

結(jié)論

在本研究中，分析了磷脂在山田錦大米（清酒釀造米）中的空間分布，并利用白鶴錦米（白鶴酒造株式會(huì)社的專有清酒米）可視化分析hazekomi過(guò)程和葡萄糖分布之間的關(guān)系。同時(shí)還利用白鶴錦米制備了一種表達(dá)GUS的米曲品系，并用于揭示hazekomi過(guò)程和葡萄糖分布之間的關(guān)系。這種新的可視化技術(shù)利用了GUS米曲和MSI相結(jié)合，可有助于更好地了解米曲和其他曲衍生產(chǎn)品的制曲流程并改進(jìn)制曲方法。由于本實(shí)驗(yàn)中采用的島津iMScope成像質(zhì)譜顯微鏡能同時(shí)實(shí)現(xiàn)微觀區(qū)域的光學(xué)顯微鏡觀察以及顯微鏡下的質(zhì)譜分析，將iMScope應(yīng)用于各種酒曲和其他麥芽的分析，可以獲得發(fā)酵領(lǐng)域相關(guān)新科學(xué)知識(shí)。

iMScope QT（圖9）是iMScope的新一代產(chǎn)品，于2020年6月發(fā)布。在延續(xù)iMScope TRIO的顯微鏡觀察功能和空間分辨率的同時(shí)，新的iMScope QT提供了更高的質(zhì)量分辨率、檢測(cè)靈敏度和分析速度，讓分析變得更輕松。同時(shí)，由于能夠分析更寬的質(zhì)量范圍，期待MSI技術(shù)可以進(jìn)一步擴(kuò)展在不同研究領(lǐng)域應(yīng)用的可能性。

圖 9 iMScope QT

<參考文獻(xiàn)>

(1) K. Miyoshi, Y. Enomoto, E. Fukusaki, and S. Shimma, Shimadzu Application Note (No. 57).

(2) S. Shimma and T. Sagawa, Shimadzu Application Note (No. 63).

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(4) N. Zaima, N. Goto-Inoue, T. Hayasaka, and M. Setou, Rapid Commun.Mass Spectrom., 2010, 24, 2723.

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(6) A.P.Wisman, Y. Tamada, S. Hirohata, K. Gomi, E. Fukusaki, and S. Shimma, J. of Brew.Soc.Japan (in press).

(7) M. Yoshii and I. Aramaki, J. of Brew.Soc.Japan, 2001, 96, 806.

(8) J. Wang et al., Anal.Chem., 2015, 87, 422.

文獻(xiàn)題目

《成像質(zhì)譜顯微鏡用于米曲中磷脂和葡萄糖的可視化分析》

使用儀器

島津iMScope TRIO

作者

Shuichi Shimma *1, 2, Yoshihiro Tamada *3, Adinda Putri Wisman *1, Shuji Hirohata *3, Katsuya Gomi *4 Eiichiro Fukusaki *1,2

*1 大阪大學(xué)工程研究生院生物技術(shù)系

*2 大阪大學(xué)島津組學(xué)創(chuàng)新研究室

*3 白鶴酒造株式會(huì)社

*4 日本東北大學(xué)農(nóng)學(xué)研究生院未來(lái)生物產(chǎn)業(yè)的生物科學(xué)與生物技術(shù)系