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人成纖維細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)促進缺氧條件下骨橋蛋白的誘導

來源:上海泉眾機電科技有限公司   2022年05月30日 10:45  
腎功能衰竭是一個重大的公共衛(wèi)生問題,發(fā)病率每年都在增加。終末期腎病患者需要腎移植或血液透析才能維持生命。動靜脈內(nèi)瘺(AVF)作為血液透析的血管通路。只有 50% 的 AVF 在創(chuàng)建六個月后仍保持功能,這增加了患者的發(fā)病率和死亡率。一些臨床因素似乎與 AVFs 功能障礙有關(guān),包括性別、年齡或糖尿病。組織學上,功能障礙最常見的原因是內(nèi)膜增生(NH),它是狹窄的原因。在 AVF 的 NH 中已經(jīng)確定了不同的機制,包括成纖維細胞分化為肌成纖維細胞、平滑肌細胞增殖和內(nèi)皮細胞活化。

越來越多的證據(jù)支持 HIF 通路對影響血管壁的疾病(包括動脈粥樣硬化,動脈瘤,肺動脈高壓,血管移植失敗,慢性靜脈疾病和血管畸形)的發(fā)病機制的保護和破壞作用。此外,VEGF-A(一種 HIF-1α 靶基因)的表達增加可能通過增加平滑肌細胞的增殖而促成 NH。最近的一項研究表明,在 AVF 形成過程中降低 VEGF-A 基因表達會降低 NH。

骨橋蛋白(OPN)是一種 SIBLING 蛋白(小整合素結(jié)合配體 N 端連接糖蛋白),最初被鑒定為將骨細胞與細胞外基質(zhì)連接起來的骨基質(zhì)蛋白。OPN 有兩種亞型,即分泌型(sOPN)和胞內(nèi)型(iOPN),它們具有不同的生物學功能。OPN 參與多個過程,包括組織重塑、細胞免疫調(diào)節(jié)、病理性慢性炎癥過程、癌變以及心血管疾病。特別是,已發(fā)現(xiàn)它在人再狹窄性血管病變和狹窄性血管病變的血管平滑肌細胞中表達。

活性氧(ROS)和高血糖在胰腺上皮細胞和血管平滑肌細胞中誘導 OPN 的體內(nèi)表達。盡管已顯示缺氧狀態(tài)時 OPN 的上調(diào)依賴或獨立于 HIF-1 的調(diào)控,但 OPN 表達在缺氧條件下通過不同的機制增強,導致與 VEGF 共表達。

鑒于氧濃度的變化發(fā)生在 AVF 的手術(shù)創(chuàng)建過程中與 OPN 過表達同時發(fā)生,法國蔚藍海岸大學、法國尼斯大學中心醫(yī)院血管外科、摩納哥科學中心的課題組認為 OPN 是由缺氧誘導的,因此可能由于 NH 和近端吻合口狹窄而導致 AVF 成熟失敗。他們假設(shè)通過沉默 HIF 或 NF-kB 來調(diào)節(jié) OPN 可以促進 AVF 成熟。最后還描述了一種體外共培養(yǎng)細胞模型,該模型在缺氧條件下誘導 OPN,但僅在細胞-細胞相互作用的條件下。




在缺氧細胞中不誘導細胞內(nèi) OPN(iOPN)

首先,實驗評估了 AVF 患者中 OPN 的表達水平。與對照靜脈相比,AVF 中 OPN mRNA 的表達(圖1 A)和 OPN 免疫反應性(圖1 B)均顯著增加,證實了之前的結(jié)果以及 OPN 在 AVF 成熟中的潛在作用。

然后在不同的細胞模型中通過免疫印跡對 iOPN 進行表征。重組 OPN(recOPN)用于定量表達(圖1 C)。人骨髓間充質(zhì)細胞成骨細胞(圖1 D)和 LNCap 細胞(圖1 E)作為對照進行檢查,因為這兩個模型已知表達 OPN。針對 OPN 的抗體檢測到的 recOPN 濃度為 50 和 16.6 ng,相對分子量為 70 kDa(圖1 C)。人骨髓間充質(zhì)細胞和成骨細胞在培養(yǎng) 48 小時后在常氧環(huán)境中顯示出 iOPN 的高表達。

由于 iOPN 在 LNCaP 中表達,評估了這些細胞中 iOPN 的潛在缺氧誘導,并觀察到了輕微的誘導(圖1 E)。由于 HIF-1 是細胞適應缺氧的關(guān)鍵蛋白,實驗檢查了 HIF-1 是否參與 iOPN 的誘導。使用 siRNA 沉默 HIF-1α,發(fā)現(xiàn)在沒有 HIF-1α 的情況下,iOPN 表達仍然存在。只有 OPN 應用 siRNA#2 *消除了 iOPN 的表達。

隨后的實驗是用這種 siRNA 對 OPN 進行的。NHF(代表外膜;圖1 F),HUVSMC(代表與彈性纖維相關(guān)的平滑肌細胞;圖1 G)和 HUVEC(代表內(nèi)皮細胞;圖1 H),對構(gòu)成動脈和靜脈三層的三個細胞系進行了 iOPN 表達測試。盡管在缺氧條件下(1% O2 48 小時)檢測到 HIF-1α 和 HIF-2α ,但這些細胞均未表達 iOPN。這些細胞在常氧或缺氧的 0.2% O2 中均不表達 iOPN。用siRNA 轉(zhuǎn)染 NHF(圖1 F)、HUVSMC(圖1 G)和 HUVEC(圖1 H)后,HIF-1α 和/或 HIF-2α 大大減少了這兩個亞基的數(shù)量,而 HIF-1α 的沉默略微增加了 HIF-2α 的檢測水平,反之亦然。因此沉默了兩個亞基來*消除 HIF 的活性。

這些結(jié)果表明在 NHF 中,iOPN 表達低于 16.6 ng 的可檢測水平(圖1 C),而在 HUVSMC 和 HUVEC 中弱表達。



圖1   骨橋蛋白(OPN)在 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中弱表達,并且在缺氧時不被誘導。 



在缺氧細胞中不誘導分泌型 OPN(sOPN)

然后,實驗使用 ELISA 測試了這些細胞中的 sOPN。使用兩種不同的試劑盒,一種以納克為單位測量 sOPN(圖2 A),一個以皮克為單位(圖2 B)。當使用 recOPN 作為參考時,在常氧或缺氧或 H2O2 或葡萄糖等可能誘導 OPN 的條件下在納克水平下 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中未檢測到 sOPN(圖2 A)。

更靈敏的試劑盒檢測在 NHF 中(圖2 B)、HUVSMC(圖2 C)中檢測到 sOPN,但不在 HUVEC (圖2 D)。HNF 和 HUVSMC 在常氧環(huán)境中的 sOPN 水平相似,分別為 765 和 1060 pg/mL。SiRNA OPN(siOPN)用作對照,消除了 OPN 的分泌。然而,沒有已知的增加 OPN 的刺激物在常氧環(huán)境中激活 sOPN。缺氧條件不會增加 sOPN,并且 HIF-1α 和/或 HIF-2α 的沉默不會阻止 NHF 和 HUVSMC 中 OPN 的分泌。然而,用特異性抑制劑(IKK2(AS602868)抑制劑,iNF-κB )會輕微抑制 NF-κB 活性,但在統(tǒng)計學上 OPN 的分泌從 850 pg/mL 降低到 700 pg/mL。

這些結(jié)果證實了兩種 iOPN 的弱表達(圖1)和這些細胞中的 sOPN,并表明在 HUVEC 中未檢測到 sOPN。實驗還證實,這兩種形式在缺氧條件下不會通過 HIFs 誘導。然而表明 NF-κB 在一定程度上參與了 OPN 的調(diào)控。


圖2   與缺氧相比,在常氧下由 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 產(chǎn)生 OPN。



共培養(yǎng)有利于缺氧條件下 OPN 的誘導

最后,鑒于 OPN 和 AVF 之間的潛在聯(lián)系已在小鼠模型的成熟過程早期顯示,其中三層細胞并列,實驗使用不同的組合共培養(yǎng)細胞:NHF/HUVSMC、NHF/HUVEC、HUVSMC /HUVEC 和 NHF/HUVSMC/HUVEC(圖3)。NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中 OPN 的 mRNA 表達高于 NHF/HUVSMC、NHF/HUVEC、HUVSMC/HUVEC 和 NHF/HUVSMC/HUVEC 共培養(yǎng)物(圖3 A)。HUVSMC/HUVEC 的共培養(yǎng)明顯增加了 OPN 的表達水平。然后,與對照 siRNA 或 siOPN 相比,在 siRNA 不存在或存在的情況下量化了 OPN 在常氧和缺氧中的內(nèi)源性表達(圖3 B)。暴露于缺氧的 NHF/HUVSMC 和 NHF/HUVEC 的共培養(yǎng)顯示 OPN 表達增加了兩倍。HUVSMC 和 HUVEC 的細胞間相互作用顯示出 OPN 的基礎(chǔ)表達量高,是其他缺氧共培養(yǎng)中 OPN 的 16 倍,而其他共培養(yǎng)物在缺氧時未發(fā)現(xiàn)誘導。最后,所有細胞類型一起呈現(xiàn)中間表達,在常氧條件下四倍誘導,但在缺氧條件下仍然沒有誘導。

因此,使用 ELISA 測量了不同組合中的 sOPN(圖3 C)。在所有共培養(yǎng)組合中,觀察到缺氧條件下 sOPN 的誘導。此外,與沒有 HUVEC(NHF/HUVSMC,1.5 倍誘導)的組合相比,HUVEC 與 NHF(2.3 倍誘導)、HUVSMC(2.7 倍誘導)或 NHF/HUVSMC(2.4 倍誘導)的組合似乎在缺氧時刺激更多的 sOPN 誘導(NHF) 。最后,發(fā)現(xiàn) OPN 下調(diào)不會改變 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 的細胞增殖,而重組人 OPN 只會增加 HUVEC 增殖(圖3 D),表明 HUVEC 細胞對 OPN 敏感并且可以直接促成病理性 NH 的發(fā)生。

這些結(jié)果強烈表明,在沒有細胞間相互作用的情況下,OPN 表達不會在缺氧條件下被誘導。此外,不表達 OPN 的 HUVEC 細胞是 NH 過程的核心。



圖3   共培養(yǎng)在缺氧條件下誘導 OPN 表達。 



總之該研究表明,在 AVF 成熟期間發(fā)生的氧合變化可能通過內(nèi)皮細胞或至少通過形成 AVF 的不同細胞層的細胞間相互作用上調(diào) OPN 的分泌,進而增加炎癥并促進內(nèi)皮細胞增殖。



參考文獻:Sadaghianloo N, Contenti J, Dufies M, Parola J, Rouleau M, Lee S, Peyron JF, Fabbri L, Hassen-Khodja R, Pouysségur J, Bost F, Jean-Baptiste E, Dardik A, Mazure NM. Co-culture of human fibroblasts, smooth muscle and endothelial cells promotes osteopontin induction in hypoxia. J Cell Mol Med. 2020 Mar;24(5):2931-2941. doi: 10.1111/jcmm.14905. Epub 2020 Feb 7. PMID: 32032472; PMCID: PMC7077551.

圖片來源:所有圖片均來源于參考文獻

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