血清淀粉樣蛋白A(SAA)重組蛋白的應(yīng)用！

一、背景

血清淀粉樣蛋白A(SAA)重組蛋白是一種非特異性急性時相反應(yīng)蛋白，其作為炎癥標志物的臨床價值近年來得到廣泛關(guān)注。SAA水平變化對于感染性疾病的早期診斷、危險評估、療效觀察及預后評價都具有重要臨床價值。除了在細菌感染中升高外，SAA在病毒感染中亦顯著升高，根據(jù)其升高的程度或與其他指標聯(lián)合運用，可以提示細菌性或病毒性感染，從而彌補了目前常用炎癥標志物不能提示病毒感染的不足。

血清淀粉樣蛋白A(SAA)是一種非特異性急性時相反應(yīng)蛋白，其作為炎癥標志物的臨床價值近年來得到廣泛關(guān)注。SAA水平變化對于感染性疾病的早期診斷、危險評估、療效觀察及預后評價都具有重要臨床價值。除了在細菌感染中升高外，SAA在病毒感染中亦顯著升高，根據(jù)其升高的程度或與其他指標聯(lián)合運用，可以提示細菌性或病毒性感染，從而彌補了目前常用炎癥標志物不能提示病毒感染的不足。

人體A-SAA主要在肝臟中合成，由細胞因子IL-1β，IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導，這些細胞因子可以與糖皮質(zhì)激素協(xié)同作用以增強A-SAA產(chǎn)生。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在未患任何疾病的肥胖個體者的脂肪細胞中可見大量的A-SAA mRNA表達，這意味著A-SAA并不只在肝臟合成。

SAA具有以下生物學功能：

(1)SAA具有促炎活性，在SAA質(zhì)量濃度低至10μg/L時，具有誘導趨化因子和趨化白細胞遷移的能力;

(2)SAA已被描述為血管生成蛋白，在SAA質(zhì)量濃度大于10～60 mg/L時，可以刺激內(nèi)皮細胞增殖、黏附、侵襲和形成的毛細管樣結(jié)構(gòu)，刺激體內(nèi)新血管形成;

(3)SAA在生理水平通過結(jié)合外膜蛋白A作為革蘭陰性菌的調(diào)理素，從而增強細菌的吞噬作用，并且能夠在合成、重建細胞膜時形成離子通道，干擾細胞離子穩(wěn)態(tài)并引起細菌裂解;

(4)SAA具有抗病毒活性，但這種抗病毒活性可能限于丙型肝炎病毒;

(5)SAA具有誘導基質(zhì)降解酶的能力。

二、應(yīng)用

用于血清淀粉樣蛋白A1對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及其機制的實驗研究：

目的：

1、通過轉(zhuǎn)染SAA1慢病毒,明確SAA1高表達對AS斑塊穩(wěn)定性的影響；

2、探討SAA1慢病毒轉(zhuǎn)染對斑塊內(nèi)脂質(zhì)、巨噬細胞、平滑肌細胞及膠原的影響；

3、通過體內(nèi)外實驗明確SAA1對膠原表達的影響及其相關(guān)信號通路。

研究方法：

1、SAA1高表達慢病毒的構(gòu)建獲取目的基因后,經(jīng)RT-PCR擴增后將目的基因片段與慢病毒載體plenti6.3-MSC-IRES-EGFP連接,構(gòu)建成plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP,并經(jīng)轉(zhuǎn)化、包裝后測定慢病毒的滴度,用于實驗。

2、動物飼養(yǎng)及建模將100只6-8周齡的雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,給予頸動脈套管。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周后,隨機將剩余的95只ApoE-/-小鼠分為4組:Control組（n=23）、lenti-null組(n=25、low-lenti-SAA1組（n=23）及high-lenti-SAA1組（n=24）。Lenti-null組給予1x107TU空慢病毒載體,low-lenti-SAA1組給予1×107TUSAA1高表達慢病毒,high-lenti-SAA1組1×109TUSAA1高表達慢病毒,control組給予相同體積生理鹽水。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周后,小鼠空腹12小時,稱體重,以0.8%戊麻醉,打開胸腔,心臟取血,置于-80度冰箱保存,以備后續(xù)檢測。以生理鹽水灌洗心臟和主動脈,沖洗出殘余血液。部分動物繼以4%多聚甲醛固定直至肝臟變硬,收集小鼠套管近端的頸動脈,以4%多聚甲醛浸泡24小時。其余部分動物的頸動脈標本置于-80度冰箱保存。

3、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）以ELISA法檢測血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、甘油三脂及TNF-α、IL-6的濃度。

4、頸動脈油紅O染色對小鼠頸動脈進行5μm連續(xù)切片,每10張取1張用于油紅O染色,病變的嚴重程度用斑塊占頸動脈斑塊面積的百分比來表示。

5、組織免疫組織化學染色對冰凍切片行SAA1、α-SMC actin、MOMA-2、膠原I、膠原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8免疫組化染色觀察SAA高表達對斑塊SAA、α-SMC actin、MOMA-2、膠原I、膠原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8的影響。

6、Western blot檢測定量稱取凍存組織,或收集細胞,提取蛋白,采用western blot法,以GAPDH為內(nèi)參檢測SAA1、膠原I、膠原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8、MMP2、MMP9的表達；以相應(yīng)非磷酸化狀態(tài)為內(nèi)參檢測p-p38、ERK1/2、JNK、Smad2、Smad3的表達。

7、實時定量PCR（real-time PCR）檢測定量稱取凍存組織,Trizol法提取總RNA,經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后以18S為內(nèi)參檢測SAA1的表達,以確定SAA1高表達慢病毒的轉(zhuǎn)染效果。

8、免疫熒光染色重組SAA1蛋白刺激平滑肌細胞后,免疫熒光法檢測膠原I、膠原III、MMP1和MMP8的表達。

9、統(tǒng)計學分析所有數(shù)值均以均數(shù)±標準差表示。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗,正態(tài)分布的計數(shù)資料應(yīng)用Student t檢驗,多組采用方差分析（ANOVA）,非正態(tài)分布的資料行Mann-Whitney檢驗。設(shè)P<0.05有統(tǒng)計學差異。

結(jié)果：

各組小鼠的一般情況Control組（n=23）、lenti-null組（n=25）、low-lenti-SAA1組（n=23）及high-lenti-SAA1組（n=24）ApoE-/-小鼠的體重及血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的水平濃度無差異（P>0.05）。表明SAA1高表達慢病毒的局部轉(zhuǎn)染,沒有影響小鼠體內(nèi)整體的脂質(zhì)代謝。2.plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP慢病毒轉(zhuǎn)染對血清SAA1及其他炎癥因子表達的影響Control組、lenti-null組、1ow-lenti-SAA1組的血清SAA1表達幾乎沒有變化,high-lenti-SAA1組的血清SAA1表達略高于前三組,但尚未達到統(tǒng)計學差異（P>0.05）；這四個組的炎癥因子TNF-α、IL-6在血清中的分泌表達也未達到統(tǒng)計學差異（P>0.05）。表明慢病毒的局部轉(zhuǎn)染,沒有引起小鼠體內(nèi)顯著的炎癥反應(yīng)。