超純土壤基因組DNA快速提取試劑盒的應(yīng)用！

一、背景

超純土壤基因組DNA快速提取試劑盒可在30分鐘之內(nèi)，快速、有效地從土壤以及其他環(huán)境樣品中提取基因組DNA。適用于從土壤中的所有生物包括G+細(xì)菌、酵母菌、真菌、藻類、線蟲類甚至真細(xì)菌的孢子、芽孢中提取基因組DNA。而且它還可以提取其他環(huán)境樣品的DNA，如沉積物、排泄物、廢水、雪水等。只需500mg的樣品即可得到足夠的DNA。實(shí)驗(yàn)原理為用特殊的裂解介質(zhì)E處理樣品，之后使用自旋過濾器基于硅吸附DNA原理的GENECLEAN®步驟進(jìn)行純化，得到的DNA可用于PCR、限制性酶切、電泳及其他下游實(shí)驗(yàn)。

二、操作步驟

1、稱取0.3 g~0.4 g樣品加入Lysing Matrix E Tube中。（注意：需保證加完樣品及所需溶液后，管中應(yīng)留出不少于200μL空間）

2、加入978μL SPB，加入122μL MT Buffer。

3、蓋緊Lysing Matrix E Tube的蓋子，將離心管置于渦旋混合儀上，對管內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行震蕩破碎均質(zhì)化，時(shí)間設(shè)定為40 s~50 s。（注意：時(shí)間不可過長，有可能打斷基因組DNA片段降低提取質(zhì)量）從各個(gè)角度都可以震蕩一下，不要光是底部。

4、在8000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，有利于去除體積較大或具有復(fù)雜細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的樣品碎屑。

5、將上清液用大口槍頭吸出轉(zhuǎn)入1.5 mL的微離心管中，加入250μL PPS，手持離心管晃動(dòng)10次以混勻。

6、在8000 r/min下離心5 min，用大口槍頭將上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中。

7、搖勻Binding Matrix后，吸取1.0 mL加入上一步離心管中。

8、將離心管上下顛倒2 min后，靜置3 min，使DNA附著于Bingding Matrix上，并等待二氧化硅基質(zhì)沉淀。（這一步根據(jù)沉淀情況時(shí)間可以適當(dāng)延長）

10、將剩余的上清液與沉淀物重新混勻，吸取約600μL混合液移入SPIN Filter中，8000 r/min下離心1 min。

11、倒掉收集管中的液體，重復(fù)上一步操作直至5 mL離心管中的液體吸盡。

12、加入已制備好的SEWS-M溶液500μL，用小槍頭小心混勻后，8000 r/min下離心1 min后，棄去收集管中的液體。

13、為更好的去除雜離子，重復(fù)第12步，更換為1.5 mL離心管。

14、在8000 r/min下離心2 min，去除殘留的SEWS-M溶液，然后更換為干凈的1.5 mL離心管。（若發(fā)現(xiàn)殘余溶液較多，可重復(fù)此步驟）

15、在室溫下，將SPIN Filter風(fēng)干5 min。（時(shí)間可以更久一些）

16、往SPIN Filter加入80μL DES溶液，用小槍頭小心使之與Binding Matrix混勻，65℃水浴15 min（有利于DNA的溶出）。8000 r/min下離心2 min，可得到約50μL的DNA溶液。再加入80μL DES溶液重復(fù)第16步操作，一共可得到約100μL的DNA溶液。

17、棄去SPIN Filter，將提取好的DNA存于-20℃冰箱保存。

三、應(yīng)用

用于土壤中多功能木霉菌的篩選鑒定及木霉多樣性分析研究：

實(shí)驗(yàn)從四個(gè)地區(qū)的西紅柿、黃瓜大棚,韭菜、白菜菜地,大蒜、大蔥種植區(qū)采取的120份土壤樣品中分離獲得木霉244株。通過對峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對棉花棉花立枯絲核菌具有一定拮抗功能的有114株,其中拮抗作用較好的有19株;通過固體培養(yǎng)法檢測解磷、解鉀、固氮能力發(fā)現(xiàn),244株木霉中有74株具有明顯解磷圈,且發(fā)現(xiàn)拮抗效果較好的19株解磷圈較大,未發(fā)現(xiàn)有明顯解鉀透明圈的菌株,所有菌株在固氮培養(yǎng)基上無生長現(xiàn)象。

對19株拮抗效果較好且解磷圈較大的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)檢測解磷、解鉀能力,發(fā)現(xiàn),在液體培養(yǎng)條件下,部分菌株未顯示出解磷能力,菌株T13-8（1.792μg/mL）、T23（1.652μg/mL）顯示出較高的解磷能力;部分菌株在液體培養(yǎng)下顯示出一定的解鉀功能,菌株T47-4（20.585μg/mL）顯示出較高的解鉀能力。

通過平板實(shí)驗(yàn)檢測此19個(gè)菌株植酸酶活性發(fā)現(xiàn),能夠水解植酸鈣的有15株,其中包括高效解磷菌株T13-8、T23,高效解鉀菌株T47-4。對以上19個(gè)菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)菌株T8-4、T9-1、T23、T25、T30-5、T31-3、T38-5、T47-4、T35-1為Trichoderma longibrachiatum;菌株T80-2、T38-6、T13-8、T44-1、T57、T62-2、T34、T17為Trichodermaharzianum;菌株T61-2為Trichoderma virens;菌株T18-1為Trichodermacitrinoviride。依據(jù)ITS序列進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果支持此19個(gè)木霉菌株的鑒定結(jié)果。

研究土壤木霉多樣性時(shí),將來自相同地區(qū)同種蔬菜作物的土樣混合為一份土樣,120份共混成13份混合土壤樣品,設(shè)計(jì)木霉ITS區(qū)特異保守序列擴(kuò)增引物,利用PCR-DGGE技術(shù)對土壤木霉的多樣性進(jìn)行了分析。

發(fā)現(xiàn)同一地區(qū),不同蔬菜作物土壤中,木霉種類具有相似性,不同地區(qū)之間也有相似種;木霉多樣性高的地區(qū)土傳病害的發(fā)生相對較少。為了進(jìn)一步對PCR-DGGE技術(shù)用于土壤木霉多樣性分析的可行性提供理論支持,本實(shí)驗(yàn)先后通過DGGE技術(shù)對19株木霉混合基因組DNA和對應(yīng)土樣基因組DNA的PCR產(chǎn)物、4株單個(gè)木霉基因組DNA和相應(yīng)土樣基因組DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了分析,兩項(xiàng)研究都證明了DGGE技術(shù)應(yīng)用于土壤木霉多樣性分析結(jié)果的可靠性。