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通過 DNP 和 EPR 光譜研究生物活性實(shí)體的位點(diǎn)選擇性自旋標(biāo)記的新策略 Kevin Herr,Max Fleckenstein,Martin Brodrecht,Mark V. H?fler,Henrike Heise,Fabien Aussenac,Torsten Gutmann,Michael Reggelin & Gerd Buntkowsky 科學(xué)報(bào)告第11卷,文章編號(hào): 13714(2021)引用本文1265 Access this Article 1265 Accesses3 Citations1 Altmeter MetricsDetails ils摘要針對(duì)抗血小板聚集抑制劑依替非巴肽(整聯(lián)蛋白) ,提出了一種新的生物活性分子特異性自旋標(biāo)記策略,它來源于某些響尾蛇的毒液。通過特別標(biāo)記二硫鍵,這種分子可用于分析技術(shù),如電子自旋共振(ePR)和固態(tài)動(dòng)態(tài)核極化(dNP)。合成了所需的自旋標(biāo)記,并在生理?xiàng)l件下,通過還原和雙 Michael 加成的方法插入到依替非巴肽的二硫鍵中。這種方法普遍適用于含有二硫化物的生物分子,并且由于標(biāo)簽的小尺寸和以前的二硫化物連接的恢復(fù),預(yù)計(jì)將以最小的變化保持其三級(jí)結(jié)構(gòu)。高效液相色譜和質(zhì)譜分析表明,成功引入自旋標(biāo)記和 EPR 光譜證實(shí)其活性。DNP 增強(qiáng)的固體核磁共振實(shí)驗(yàn)顯示,在13C CP MAS 實(shí)驗(yàn)中,信號(hào)增強(qiáng)因子高達(dá)19,相當(dāng)于高達(dá)361的節(jié)省時(shí)間因子。這清楚地顯示了我們新的自旋標(biāo)記策略的高潛力,用于將位點(diǎn)選擇性自由基自旋標(biāo)記引入生物分子和生物固體,而不損害其構(gòu)象完整性,用于使用固態(tài) DNP 或*的 EPR 技術(shù)的結(jié)構(gòu)研究。在醫(yī)學(xué)背景下,藥物輸送及其對(duì)生物活性物質(zhì)的選擇性應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。靶向給藥與藥物在一個(gè)或多個(gè)所需結(jié)合位點(diǎn)的選擇性積累或釋放密切相關(guān)4。然而,監(jiān)測(cè)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)似乎是靶向給藥的主要挑戰(zhàn)。藥物分子的標(biāo)記極大地促進(jìn)了這種監(jiān)測(cè)。化學(xué)標(biāo)簽與生物分子的反應(yīng)殘基和特定氨基酸建立共價(jià)和穩(wěn)定的鍵。由于結(jié)合策略,它們是強(qiáng)大的,易于處理和提供最大的效率與各種潛在的目標(biāo)位點(diǎn)共價(jià)耦合6,7,8,9,10,11。特別是以肽為基礎(chǔ)的藥物作為生物活性分子越來越受到重視,用于診斷成像12。它們具有合成簡(jiǎn)便、體積小、靶向性能可調(diào)、免疫原性和細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)。它們被應(yīng)用于成像方法,如伽馬照相機(jī)閃爍掃描14、核磁共振(磁共振成像)15和正電子發(fā)射斷層掃描(正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描)16。在這種情況下,超極化分子對(duì)于提高核磁共振(核磁共振)和核磁共振(MRI)的靈敏度很有意思。動(dòng)態(tài)核極化(dNP)技術(shù)將三個(gè)數(shù)量級(jí)較高的未配對(duì)電子自旋極化轉(zhuǎn)移到核自旋極化中。這使得核磁共振實(shí)驗(yàn)的靈敏度顯著增強(qiáng)17,18,19。溶解 DNP NMR 與 HyperSense 偏振器相結(jié)合進(jìn)一步開辟了使用二氧化硅結(jié)合自由基的 DNP 成像的醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域,以促進(jìn)從超極化底物20,21,22,23,24,25中易于分離潛在有害的自由基。在這里,采用生物相容性自由基是有利的,這些自由基在體內(nèi)應(yīng)用超極化底物之前不需要被分離。一個(gè)特別有吸引力的方法是使用生物活性自由基,它結(jié)合了生理功能,例如,抑制酶,附加自旋標(biāo)簽。為了使這種方法成功,必須在最小程度上影響抑制劑的分子結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性。目前,大多數(shù) dNP 增強(qiáng)核磁共振實(shí)驗(yàn)都是使用雙自由基系統(tǒng)進(jìn)行的,因?yàn)樗鼈兙哂懈叩某瑯O化效率。然而,對(duì)于這種具有生物活性的自旋標(biāo)簽,犧牲一部分超極化并使用較小的、空間要求較低的單基如 TEMPO ((2,2,6,6-四甲基哌啶 -1-基)氧基)或 PROXYL ((2,2,5,5-四甲基吡咯烷 -1-基)氧基)似乎是有利的,這些單基對(duì)生物分子的結(jié)構(gòu)影響較小26,27,28,29,30,31,32。
將這些順磁性化合物引入生物分子而不損害其三維結(jié)構(gòu)是有機(jī)和生物化學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)主要挑戰(zhàn)。原則上,生物分子的合成后功能化有不同的途徑。一方面,已有的功能基團(tuán),如氨基、羧基和羥基可以得到解決8。另一方面,非規(guī)范的氨基酸10或6,33可以通過基因工程在生物合成過程中結(jié)合。因此,不同的結(jié)合位點(diǎn)被人工創(chuàng)造用于選擇性反應(yīng)7。例如,巰基可用于在溫和條件下選擇性偶聯(lián)馬來酰亞胺殘基34,與乙炔35和疊氮基36相同。人工結(jié)合位點(diǎn)是功能化的突出的特定靶點(diǎn),但是費(fèi)力、昂貴并且不能保證分子結(jié)構(gòu)特征的完整性。更好的選擇是使用現(xiàn)有的高特異性靶向功能。然而,含有不成對(duì)的巰基的蛋白質(zhì)是極其罕見的。相反,成對(duì)的硫醇基團(tuán),即所謂的二硫鍵,經(jīng)常存在于治療相關(guān)的蛋白質(zhì)中。這種二硫鍵可以很容易地被還原以產(chǎn)生反應(yīng)性巰基,其可以用作各種修飾的親核位點(diǎn)38,39,40,41。
在肽或蛋白質(zhì)中尋找二硫鍵的決定性優(yōu)勢(shì)是在不損害底物構(gòu)象完整性的情況下進(jìn)行位點(diǎn)選擇性標(biāo)記的可能性42?,F(xiàn)有的標(biāo)簽,如雙功能旋轉(zhuǎn)標(biāo)簽,滿足這一條件。最近,雙 MTSSL (反式 -3,4-雙[(甲基磺?;?span>)硫代]甲基] -2,2,5,5-四甲基吡咯烷 -1-氧基)被提出作為一種有效的和商業(yè)上可用的藥物,通過插入到二硫橋43,44,45,46。對(duì)于那些不需要自旋標(biāo)記的 pH 依賴性可逆性或需要還原條件下的穩(wěn)定性的應(yīng)用,有必要采用更強(qiáng)的結(jié)合方案將自旋標(biāo)記附加到生物活性分子上。這就需要使用不同的自旋標(biāo)簽插入模式。這種方法背后的化學(xué)依賴于硫醇基團(tuán)對(duì)具有離開基團(tuán)的 α,β-不飽和羰基化合物在合適烯丙基位置的兩個(gè)連續(xù)的 MICHAEL 加成。Liberatore 等[39]的雙烷基化共軛試劑依賴于亞硫酸鹽離開基團(tuán),作為結(jié)構(gòu)保留型插層劑特別成功。這已經(jīng)顯示了最初的位點(diǎn)選擇性引入無線電標(biāo)簽39和聚乙二醇化38,47。后來,Weil 等[40,48,49,50,51]開發(fā)了這種化學(xué),進(jìn)一步構(gòu)建了一個(gè)廣泛的插入劑文庫,作為具有不同功能的多功能工具包,可以實(shí)施到包括抗體在內(nèi)的許多生物分子中52。
在這里,我們想要描述雙砜基自旋標(biāo)記的合成和結(jié)合到環(huán)七肽依非巴肽(方案1)。 (整合素)1存在于某些響尾蛇的毒液中,在醫(yī)學(xué)上用作抗血小板聚集抑制劑。這種藥物的高潛力是基于其環(huán)狀結(jié)構(gòu)和 KGD 氨基酸序列(Lys-Gly-Asp)53,54,55。我們將利用高效液相色譜(HPLC)和電噴霧離子法電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)證明,選擇性地將自由基并入二硫鍵是可能的。(工業(yè)和信息化部電子科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所質(zhì)譜法)。通過 EPR 實(shí)驗(yàn)證明插層化學(xué)不影響自由基活性,并通過 DNP 實(shí)驗(yàn)證明了其潛在的應(yīng)用范圍。
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