1971 年，Judah Folkman 教授提出 “腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生” 理論，認(rèn)為新血管的形成對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。血管生成和細(xì)胞侵襲怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)？想要具體實(shí)驗(yàn) Protocol？ 一文帶你走進(jìn)熱門(mén)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為發(fā)表高分文獻(xiàn)提供新思路，“膠”你做實(shí)驗(yàn)！

基底膜是一層特化薄而柔韌的胞外基質(zhì) (無(wú)細(xì)胞薄膜狀結(jié)構(gòu))，位于上皮細(xì)胞基底面與深部結(jié)締組織間。基底膜在發(fā)育和傷口愈合時(shí)會(huì)發(fā)生退化及再生，它不僅為細(xì)胞和細(xì)胞層提供支持，也為血管生成提供其所必需的環(huán)境，還是轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞侵襲的主要屏障。此外，基底膜還可通過(guò)影響細(xì)胞粘附、遷移、增殖和分化對(duì)組織形成產(chǎn)生重要作用[1]。

圖 1. 間質(zhì)基質(zhì)和基底膜的組成^[1]。

基底膜基質(zhì)膠 (Basement Membrane Matrix) 是從富含胞外基質(zhì)蛋白的小鼠腫瘤中提取出的天然基底膜基質(zhì)，主要成分是各類(lèi)生長(zhǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)成分。

Tips!

基質(zhì)膠主要細(xì)胞外基質(zhì)成分有：層粘連蛋白 (Laminin)、IV 型膠原蛋白 (Col-IV)、巢蛋白 (Entactin)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖 (Heparan sulphate proteoglycans) 等。

基質(zhì)膠也包含多種生長(zhǎng)因子，例如：類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子 (IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子  β (TGF-β)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子 (EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF) 等。

基于基底膜基質(zhì)膠的組成及特性，基底膜基質(zhì)膠對(duì)于體外模擬細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境提供了非常重要的支持，其應(yīng)用包括免疫缺陷型小鼠體內(nèi)腫瘤形成、類(lèi)器官培養(yǎng)、腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、體外和體內(nèi)血管生成研究、干細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和分化等。

MCE 基質(zhì)膠產(chǎn)品適用多個(gè)研究領(lǐng)域，批次間穩(wěn)定性高，部分產(chǎn)品如下：

腫瘤組織具有高度血管化的特征，腫瘤的生長(zhǎng)依賴于新生血管。由于血管生成 (Angiogenesis) 對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和侵入轉(zhuǎn)移、特別對(duì)腫瘤早期發(fā)生的重要影響，已成為近年來(lái)腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。

由于內(nèi)皮細(xì)胞在基底膜提取物上培養(yǎng)時(shí)可形成三維毛細(xì)血管樣管狀結(jié)構(gòu)，血管生成實(shí)驗(yàn)成為一種簡(jiǎn)單、定量、可靠且功能強(qiáng)大的模型，常用于研究抑制劑和激活劑對(duì)血管生成的影響。

?【實(shí)驗(yàn)步驟】
1. 準(zhǔn)備基質(zhì)膠

實(shí)驗(yàn)前一天將 -20℃ 保存的基質(zhì)膠埋于碎冰放入 4 ℃ 冰箱，使基質(zhì)膠過(guò)夜緩慢融化。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將基質(zhì)膠放在冰盒中，將 96 孔板和 1 mL 槍頭放置在冰上預(yù)冷，基質(zhì)膠用預(yù)冷槍頭混勻。

2. 鋪基質(zhì)膠

準(zhǔn)備預(yù)冷的 1.5 mL 離心管用于稀釋基質(zhì)膠，以基質(zhì)膠: DMEM 培養(yǎng)基為 1:1 或 2:1 的稀釋比稀釋。稀釋后向 96 孔板每孔加入 50-80 µL 稀釋后的基質(zhì)膠，垂直加入避免產(chǎn)生氣泡。在 37℃ 培養(yǎng)箱中放置 45 分鐘~1 小時(shí)使基質(zhì)膠凝固。

3. 鋪細(xì)胞

使用 3-5 代狀態(tài)較好的 HUVEC 細(xì)胞，消化細(xì)胞，用含 10% 血清的 DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。96 孔板每孔加入 50-100 µL，3-5 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的重懸液，每組重復(fù)三孔。將 96 孔板置于 37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4-12 小時(shí)后可見(jiàn)血管形成。

4. 定量分析

使用 ImageJ 中 Angiogenesis Analyzer 插件對(duì)血管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)。

?【結(jié)果示例圖】

(A) Aspirin 對(duì)基質(zhì)膠上 HUVEC 管形成的影響; (B) HUVEC 細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)應(yīng)用 ImageJ-Angiogenesis Analyzer 分析 (綠色，分支；洋紅，節(jié)段；藍(lán)色包圍的紅色，接合處；青色，網(wǎng)格；紫色，錨定接合處)。

?【注意事項(xiàng)】

1. 為什么基質(zhì)膠液面不平有氣泡？

鋪膠時(shí)手持移液槍垂直于 96 孔板內(nèi)孔的正上方垂直加入，防止基質(zhì)膠沾到孔壁上。當(dāng)剛加膠時(shí)出現(xiàn)明顯的氣泡，可使用吸頭輕觸戳破，后續(xù)搖平即可。若孔底部沒(méi)有鋪勻，可晃動(dòng)孔板使其均勻鋪于底部。
2. 成管時(shí)間怎么判斷？
成管時(shí)間與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)，2-3 小時(shí)開(kāi)始成管，細(xì)胞狀態(tài)較差時(shí)，可能 18-24 h 成管；如果使用原代內(nèi)皮細(xì)胞而非永生化細(xì)胞，開(kāi)始成管的時(shí)間會(huì)延遲幾個(gè)小時(shí)；建議實(shí)驗(yàn)每 4 個(gè)小時(shí)觀察一次。

細(xì)胞侵襲 (Cell invasion) 是指細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)從一個(gè)區(qū)域遷移到另一個(gè)區(qū)域的能力，是正常細(xì)胞或癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)和機(jī)械刺激做出的正常反應(yīng)，通常發(fā)生在胚胎發(fā)育、血管生成、傷口修復(fù)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和癌癥轉(zhuǎn)移等過(guò)程中。

圖 3. Transwell 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)示意圖^[4]。

在腫瘤相關(guān)研究中，利用 Transwell 小室檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力十分常見(jiàn)。在 Transwell 小室的聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層基質(zhì)膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶消化基質(zhì)進(jìn)入下室，最后計(jì)算下室的細(xì)胞量即可反映細(xì)胞的侵襲能力。

?【實(shí)驗(yàn)步驟】

1. 準(zhǔn)備基質(zhì)膠

實(shí)驗(yàn)前一天將 -20℃ 保存的基質(zhì)膠埋于碎冰放入 4℃ 冰箱，使基質(zhì)膠過(guò)夜緩慢融化。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將基質(zhì)膠放在冰盒中，將 24 孔板和 1 mL 槍頭放置在冰上預(yù)冷，基質(zhì)膠用預(yù)冷槍頭混勻。

2. 鋪基質(zhì)膠

準(zhǔn)備預(yù)冷的 1.5 mL 離心管用于稀釋基質(zhì)膠，以基質(zhì)膠: DMEM 培養(yǎng)基為 1:8 的稀釋比稀釋 (根據(jù)細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的含量，稀釋比例需要摸索)。取 60-100 μL基質(zhì)膠添加到 Transwell 小室上層 (注意不要出現(xiàn)氣泡)，于 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 3 h，使基質(zhì)膠聚合成薄膜。孵育后將上室中多余液體吸掉，每孔加入 100 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基后，于 37℃ 培養(yǎng)箱放置 30 min，進(jìn)行基底膜水化。

3. 鋪細(xì)胞

在 24 孔板下室加入 600 μL 含有 10% 胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。消化細(xì)胞，用 PBS 清洗細(xì)胞，使用含有 BSA 的無(wú)血清培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度至 1-10×105個(gè)/mL (不同細(xì)胞大小和侵襲能力不同，可設(shè)置濃度梯度以達(dá)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。用鑷子將 Transwell 小室置于 24 孔板內(nèi) (注意不要產(chǎn)生氣泡)，取 100-200 μL 細(xì)胞懸液，加入 Transwell 小室上層。將 24 孔板置于 37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24-72 h (依照細(xì)胞侵襲能力而定)。

4. 結(jié)晶紫染色

棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，24 孔板加入 500 μL 4% 多聚甲醛固定液固定 30 分鐘，PBS 清洗。加入 500 μL 結(jié)晶紫溶液，染色 30 分鐘，使用 PBS 清洗去除浮液。適當(dāng)風(fēng)干后即可進(jìn)行顯微鏡觀察、拍照和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

?【結(jié)果示例圖】

圖 4. MDA-231 細(xì)胞和 MDA-231-HM 細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)^[5]。

?【注意事項(xiàng)】

1. 結(jié)晶紫染色后細(xì)胞分布不均一？

可能原因：Transwell 小室傾斜放置在孔板中；細(xì)胞消化不；細(xì)胞懸液添加不均勻；基質(zhì)膠膠面不均勻。

2. Transwell 小室下層細(xì)胞過(guò)少？

可能原因：細(xì)胞的侵襲能力弱；基質(zhì)膠濃度偏高厚度偏厚；細(xì)胞接種數(shù)量少；Transwell 小室孔徑偏??；Transwell 小室放入孔板時(shí)有氣泡等。

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本期為大家介紹了血管生成和細(xì)胞侵襲的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和注意事項(xiàng)，各位小伙伴們！或許你有其他想要了解的實(shí)驗(yàn) Protocol？ 小 M 歡迎大家留言評(píng)論，安排您的 “專(zhuān)屬” 實(shí)驗(yàn)操作指南或相關(guān)主題講座喔~  
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參考文獻(xiàn)：
[1] Bonnans C, et al. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014 Dec;15(12):786-801.
[2] Dai X, et al. Aspirin Inhibits Cancer Metastasis and Angiogenesis via Targeting Heparanase. Clin Cancer Res. 2017 Oct 15;23(20):6267-6278.
[3] Carpentier G,et al. Angiogenesis Analyzer for ImageJ - A comparative morphometric analysis of "Endothelial Tube Formation Assay" and "Fibrin Bead Assay". Sci Rep. 2020 Jul 14;10(1):11568.
[4] Justus CR, et al. Transwell In Vitro Cell Migration and Invasion Assays. Methods Mol Biol. 2023;2644:349-359.
[5] Zhu Y,et al. Exosomal MMP-1 transfers metastasis potential in triple-negative breast cancer through PAR1-mediated EMT. Breast Cancer Res Treat. 2022 May;193(1):65-81.