化合物庫不僅僅可以應(yīng)用于藥物篩選，更多情況下我們可以將其靈活應(yīng)用于信號(hào)通路的分子機(jī)制研究，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶基因 。 一定有新的小伙伴開始暈乎乎了 ，趁著今天復(fù)盤，小 M 帶你溫故而知新？

 2023 年客戶引用 MCE 化合物庫發(fā)表了 100+ 篇文獻(xiàn)，其中分的文獻(xiàn)是發(fā)表在 Cancer Discovery 雜志上的 “An African-Specific Variant of TP53 Reveals PADI4 as a Regulator of p53-Mediated Tumor Suppression”，影響因子已趨近 30。接下來咱們就通過揭示 p53 腫瘤抑制新機(jī)制的這篇文獻(xiàn)，來看看化合物庫應(yīng)該如何用?

腫瘤抑制因子 p53 由 TP53 編碼并參與到人類一半以上癌癥的調(diào)控，突變型 p53 會(huì)抑制 WT p53 的功能并促進(jìn)細(xì)胞增殖、上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成、轉(zhuǎn)移和耐藥的發(fā)生。

在這項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)試圖通過探索特殊的 TP53 突變?nèi)绾尾荒芤种颇[瘤，進(jìn)而轉(zhuǎn)變確定 p53 是如何抑制腫瘤的。已有的研究結(jié)果表明 Y107H 是一種結(jié)構(gòu)上與  WT p53 相似，并在一小部分 p53 靶基因的反激活中存在缺陷的非洲特異的種系變體，為此本文作者展開了基于 Y107H 的研究。更重要的是，作者發(fā)現(xiàn) Y107H  保留了大部分 p53 功能，但小鼠卻患上了癌癥……

首先作者展開了對(duì) Y107H 的功能研究，發(fā)現(xiàn)  Y107H 變體在生長抑制和細(xì)胞凋亡方面與 WT p53 相當(dāng)。例如，Y107H 的集落抑制受到適度損害。Doxorubicin 和 γ 輻射處理導(dǎo)致 Y107H LCL 細(xì)胞凋亡有所增加。接下來，用 Nutlin-3a  (nutlin) 或 Cisplatin 處理 Y107H 雜合子和 WT p53 的人類 LCL 細(xì)胞進(jìn)行 RNA 測序 (RNA-seq)。該分析揭示了 WT 和 Y107H LCL 中幾乎相同的 p53 靶點(diǎn)激活。然而，在獨(dú)立樣本進(jìn)行 qRT-PCR 分析時(shí)，發(fā)現(xiàn) p53 的靶標(biāo) PLTP、PADI4 和 HHAT 受到 nutlin 誘導(dǎo)的反式激活明顯受損。Western blot 實(shí)驗(yàn)表明在蛋白質(zhì)水平上 Y107H LCLs 在 nutlin 處理后，PADI4 上調(diào)受阻。γ 輻射后，Y107H 小鼠脾臟和胸腺中的 PADI4 免疫染色也明顯減少 (圖 1)。

圖 1. Y107H 變體對(duì) p53 靶基因子集的反式激活受損^[1]。 

(A) 使用 10 μmol/L nutlin 0、8 和 24 小時(shí)后，對(duì) WT 和 Y107H LCL 中CDKN1A (p21)、PADI4、PLTP和HHAT表達(dá)水平的平均表達(dá) ± SD 進(jìn)行定量 PCR 分析（ n = 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)） 。表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為 GAPDH。(B) 10 μmol/L nutlin 處理 0、8 和 24 小時(shí)后，WT 和 Y107H 細(xì)胞中 PADI4 和 p53 靶蛋白的蛋白質(zhì)印跡。包括 Nutlin 處理 24 小時(shí) PADI4 蛋白水平的密度測定值，并標(biāo)準(zhǔn)化為 GAPDH。分析代表多個(gè)獨(dú)立重復(fù)。(C) 來自 WT、Y107H 和 PADI4 KO 小鼠 IHC 的陽性細(xì)胞百分比定量。(D) 來自接受 5 Gy 照射的 Hupki WT、Y107H 和 PADI4 敲除 (KO) 小鼠的 IHC，4 小時(shí)后進(jìn)行分析（每個(gè)條件 n = 3 只小鼠），并對(duì)脾臟中的 PADI4 表達(dá)進(jìn)行染色，比例尺，50 μm。

ChIP-qPCR 分析表明，與 WT p53 相比，Y107H 在其反應(yīng)元件處與染色質(zhì)的結(jié)合能力略有下降，與 HHAT、PLTP 和 PADI4 等靶標(biāo)的啟動(dòng)子的結(jié)合存在障礙。

結(jié)構(gòu)決定功能，Y107H 與 WT p53 功能的不同也暗示著結(jié)構(gòu)上的差異。研究人員觀察到 Y107H 核心結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)與 WT p53 的結(jié)構(gòu)非常相似，但 Y107H 的核心結(jié)構(gòu)域在熱穩(wěn)定性降低，也顯示出明顯增強(qiáng)的聚集。免疫熒光分析證實(shí)，Y107H 有更強(qiáng)的錯(cuò)誤折疊成突變體構(gòu)象的傾向性。

圖 2. Y107H 變體表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性降低和錯(cuò)誤折疊傾向增加^[1]。

(A) Y107H 的晶體結(jié)構(gòu)。p53 Y107H （黃色） 與 p53 R273H/S240R（青色）的疊加。Y107H 突變以洋紅色顯示。Zn²⁺ 被繪制為灰色球體。(B) p53 Y107H 結(jié)構(gòu)中 H107（洋紅色）的插圖。(C) 通過 DSF 測量，Y107H 突變?cè)跓崃W(xué)上使核心結(jié)構(gòu)域不穩(wěn)定。(D) 40°C 下觀察 WT 和 Y107H 核心結(jié)構(gòu)域的聚集動(dòng)力學(xué)。

為了探究 Y107H 在體內(nèi)的腫瘤抑制能力，研究人員在 C57Bl/6 背景下檢測了攜帶 WT p53 或 Y107H 變體純合子的小鼠自發(fā)腫瘤形成。相比于 WT 小鼠，超過 30% 的 Y107H 小鼠在相同時(shí)間內(nèi)發(fā)生了腫瘤。此外，作者對(duì) WT 和 Y107H 小鼠進(jìn)行了分次輻射，發(fā)現(xiàn)相比于 WT 小鼠，Y107H 小鼠的 T 細(xì)胞淋巴瘤增加并不明顯，但 Y107H 小鼠的彌散性淋巴瘤顯著增加，且小鼠的脾臟和肝臟體積明顯增大 (圖 3 A-C)。

此外，用腺病毒 E1A 和突變 Ras 轉(zhuǎn)化 WT 和 Y107H MEF，將 E1A/Ras MEF 皮下注射到免疫受損小鼠中，并測量腫瘤隨時(shí)間的生長情況。Y107H E1A/Ras 腫瘤的生長速度明顯快于 WT 腫瘤 (圖 3D-E)。

圖 3. Y107H 小鼠自發(fā)性和誘導(dǎo)性癌癥的發(fā)生率增加^[1]。 

(A) Y107H 小鼠與 WT 分級(jí)放療后收獲時(shí)肝臟、脾臟和胸腺大小的代表性圖像。(B-C) 來自健康年齡匹配小鼠或接受分割放療的小鼠的脾臟（B）和肝臟（C）組織的平均重量。(D-E)將 E1A/Ras MEF 皮下注射到免疫受損小鼠中的腫瘤重量腫瘤體積 (L) 和代表性腫瘤大小 (E)，顯示為平均重量。

再接下來的研究中，作者通過使用化合物庫開展高通量篩選，來鑒定與 Y107H 存在關(guān)聯(lián)的小分子化合物，從而進(jìn)一步去闡明以及完善 Y107H 的功能。

前期已有的研究表明，化療化合物對(duì) P47S (一種 TP53 變體) 的腫瘤細(xì)胞的敏感性更高，所以作者想要探究 Y107H 是否也如此。因此，本文作者選擇約 2,000 個(gè)抗癌化合物對(duì) Y107H 克隆細(xì)胞系進(jìn)行篩選 (圖 5A)。 
作者鑒定到的了大約 24 種化合物，在兩個(gè) Y107H 克隆中與親本相比，IC₅₀ 降低了 3 倍 (圖 4B)，其中 CB-839 (HY-12248) 和 BPTES 兩種化合物是谷氨酰胺酶抑制劑。隨后作者選擇了 CB-839 進(jìn)行了進(jìn)一步的體內(nèi)抗腫瘤活性篩查。NSG 小鼠皮下注射 WT 或 Y107H HCT116 細(xì)胞并測量腫瘤生長情況，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到約 50 mm3時(shí)，每天兩次灌胃 200 mg/kg 對(duì)照組或 CB-839 治療組，結(jié)果顯示 Y107H 腫瘤比 WT 腫瘤長得更大，親代 HCT116 腫瘤在 CB-839 處理后沒有顯示出抗腫瘤作用，而 Y107H 腫瘤在 CB-839 處理組中生長顯著減少 (圖 5C-E)。

圖 5. Y107H 結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺酶抑制劑 CB-839 的敏感性增加^[1]。 

(A) 帶有 Y107H 突變的 HCT116 結(jié)直腸癌細(xì)胞（克隆 A11 和 C2）的 CRISPR 生成以及隨后篩選誘導(dǎo) Y107H 克隆活力喪失增強(qiáng)的化合物的示意圖。(B) 使用 WT p53 或 Y107H 克隆 A11 和 C2 檢測化合物針對(duì) HCT116 細(xì)胞的 IC₅₀ 值。指出了在兩個(gè) Y107H 克隆中顯示出顯著增加的敏感性的化合物。(C) 在媒介物或 CB-839 處理后，NSG 小鼠中帶有 WT p53 或 Y107H 克隆 A11 的 HCT116 細(xì)胞的腫瘤生長。腫瘤達(dá)到 50 mm 3后，通過口服管飼法每天 2 次施用媒介物或 CB-839。線性混合模型估計(jì)了 CB-839 治療降低腫瘤生長率（mm³/天）的差異。(D) 最終腫瘤體積，顯示為用載體或 CB-839 處理的 HCT116 腫瘤的平均體積。(E) 用載體或 CB-839 治療的 HCT116 腫瘤的代表性圖像。

前期已有研究表明 ATF4 通路會(huì)被被營養(yǎng)剝奪和 CB-839 處理激活，因此在接下來的研究中作者著重討論了 ATF4 與 Y107H 的潛在聯(lián)系。數(shù)據(jù)結(jié)果將 p53 對(duì)腫瘤的抑制與 PADI4 潛在的免疫表型聯(lián)系起來，PADI4 與 p53 相互作用，具有腫瘤抑制作用，并在 p53 靶基因子集的轉(zhuǎn)錄中與 p53 合作。此外，PADI4 表達(dá)增加與黑色素瘤患者的免疫反應(yīng)增加以及生存率和免疫治療反應(yīng)增加相關(guān)。

本篇文章在確定了對(duì) Y107H 研究的前提下，首先對(duì) Y107H 體內(nèi)以及體外的功能進(jìn)行了解析，結(jié)構(gòu)的改變往往是導(dǎo)致功能發(fā)生轉(zhuǎn)變的主要原因，因此作者接下來對(duì) Y107H 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。隨后，作者通過高通量篩選將 Y107H 與小分子化合物的作用靶點(diǎn)相連接，在篩選到先導(dǎo)化合物之后，作者對(duì) CB-839 的體內(nèi)外活性展開了研究，并基于 CB-839 前期的研究報(bào)道，將 Y107H 與 PADI4 聯(lián)系起來，并在不同研究水平以及研究體系對(duì)機(jī)制進(jìn)行闡述。

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參考文獻(xiàn)：
[1] Indeglia A, et al. An African-Specific Variant of T P53 Reveals PADI4 as a Regulator of p53-Mediated Tumor Suppression. Cancer Discov. 2023 Jul 7;13(7):1696-1719.