洗滌不充分

 ● 增加洗滌次數(shù)

 ● 增加洗液體積

 ● 延長洗滌時間

 ● 確認Tween^® 20 (*)濃度

 無法阻斷非特異性結(jié)合

 ● 重新調(diào)節(jié)封閉溫度和時間。室溫下1 h，4℃下過夜

 ● 添加Tween^® 20 (*)

 ● 使用添加Tween^® 20 (*)的封閉緩沖液（TBS-T、PBS-T）

 ● 使用高靈敏度發(fā)光試劑（Immunostar^® 系列）

 膜處理不當

 ● 對膜進行必要的前處理

 ● 使用干凈的鑷子和手套，注意不要損壞膜。

 ● 孵育時振蕩

 ● 使用低背景且可高靈敏度檢測靶蛋白的CLEARTRANS^® 系列產(chǎn)品

 因設(shè)備、器皿的污垢造成的污染

 ● 充分清洗轉(zhuǎn)膜裝置、電泳槽等設(shè)備，操作過程中佩戴手套

 強化學(xué)發(fā)光信號

 ● 縮短檢測的曝光時間

 ● 縮短檢測試劑的反應(yīng)時間

 ● 降低檢測試劑的濃度

 電壓過高發(fā)熱

 ● 降低電壓進行電泳

 鹽濃度不同

 ● 鹽濃度越高，移動速度越快，需統(tǒng)一樣品的鹽濃度

 上樣量不同

 ● 統(tǒng)一各個孔的上樣量

 有空孔

 ● 在空孔中上樣相同鹽濃度、相同液量的樣品，或僅上樣樣品緩沖液

 樣品存放時間久，存儲方法不當，

導(dǎo)致蛋白降解

 凝膠和膜之間有氣泡

 ● 使用滾筒等去除氣泡

 轉(zhuǎn)膜設(shè)備的問題

 ● 使用半干式設(shè)備時，反復(fù)使用會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜板彎曲，建議返廠維修或更換

    新的設(shè)備

 轉(zhuǎn)膜方法的問題

 ● 半干式設(shè)備容易引起轉(zhuǎn)膜不均勻的問題，可嘗試更換為濕轉(zhuǎn)儀

 蛋白量過高

 ● 降低電泳的蛋白量

 抗體濃度高

 ● 降低一抗、二抗的濃度

 檢測信號高

 ● 縮短曝光時間

 ● 縮短檢測試劑的反應(yīng)時間，反應(yīng)后盡可能去除試劑

 ● 降低二抗?jié)舛?/span>

 蛋白量高

 ● 減少蛋白量

 抗體濃度高

 ● 降低一抗、二抗的濃度

 抗體失活

 ● 檢查抗體存儲狀態(tài)，時間

 ● 重新進行抗體反應(yīng)時，推薦使用10 min即可去除抗體的“WB膜再生液“

 抗體結(jié)合力不足

 ● 確認抗體的稀釋濃度是否合適

 ● 延長抗體反應(yīng)時間

 ● 對于低蛋白表達量的樣品，可增加電泳量，提高抗體濃度

 ● 使用抗原抗體反應(yīng)促進試劑

 ● 更換高效轉(zhuǎn)膜緩沖液

 疊氮-化鈉抑制酶反應(yīng)

 ● 疊氮-化鈉會抑制HRP的活性，因此抗體中含疊氮-化鈉時，需要稀釋抗體

   以降低疊氮-化鈉濃度或使用不含疊氮-化鈉的抗體

 ● 使用HRP標記一抗且阻斷劑中含有疊氮-化鈉時，需在封閉后使用 TBS-T

   清洗再進行抗體反應(yīng)

 曝光時間短

 ● 延長曝光時間

 封閉時間不當

 ● 封閉時間過長時，封閉劑會遮蓋抗原，降低抗體反應(yīng)性，因此需要確認封

   閉時間是否合適

 轉(zhuǎn)膜效率低，無法轉(zhuǎn)膜

 ● 延長轉(zhuǎn)膜時間

 ● 靶蛋白的分子量較高時(例：100   kD以上)，添加0.1%的SDS(十二烷基硫

   酸鈉)

● 使用預(yù)染蛋白Marker作為陽性對照，確認轉(zhuǎn)膜效率

 ● 使用具有抗體結(jié)合位點的分子量Marker作為陽性對照

 檢測試劑的化學(xué)發(fā)光弱

 ● 確認檢測試劑是否變質(zhì)

 ● 使用高靈敏度的發(fā)光試劑“ImmunoStar^®系列“

 鑷子被污染

 ● 鑷子上的污垢會附著在膜上形成背景。需使用經(jīng)乙醇消毒后的干凈鑷子

   夾住膜的邊緣

 洗滌不充分

● 增加洗滌次數(shù)和洗液體積

 抗體反應(yīng)不當

 ● 增加抗體反應(yīng)溶液，并振蕩使其反應(yīng)

 檢測設(shè)備被污染

● 檢測前，使用乙醇擦拭放置膜的樣品臺，去除污垢

 蛋白未轉(zhuǎn)膜

 ● 確認轉(zhuǎn)膜設(shè)備是否正確運行

 ● 確認膜和凝膠是否正確接觸

 低蛋白量

● 增加蛋白的上樣量

 染色試劑變質(zhì)

 ● 檢查染色試劑的有效期

 ● 更換凝膠染色試劑（Negative Gel Stain MS Kit、Ponceau 3R、

   Ponceau-3R StainSolution、Amido Black 10B）