Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation

Keywords: BACH1; YAP; atherosclerosis; endothelial inflammation; hemodynamics.

動(dòng)脈粥樣硬化是冠狀動(dòng)脈疾?。–AD）的主要原因。內(nèi)皮功能障礙和血管炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）已發(fā)現(xiàn)與CAD 發(fā)病相關(guān)的多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子BACH1（BTB-CNC 同源體1）的表達(dá)與冠心病風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)rs2832227單核苷酸多態(tài)性密切相關(guān)，先前被確定為 CAD 的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。以往研究表明，BACH1 增加內(nèi)皮細(xì)胞（EC）凋亡，減少 EC 增殖和遷移，并抑制缺血和發(fā)育性血管生成。據(jù)報(bào)道，Bach1 的整體敲除可上調(diào)載脂蛋白E-缺陷小鼠的血紅素加氧酶-1（HO-1）表達(dá)并減輕動(dòng)脈粥樣硬化。然而，BACH1 如何導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的潛在機(jī)制仍不清楚。

動(dòng)脈分支和主動(dòng)脈弓（AA）的血流模式受到干擾，內(nèi)皮細(xì)胞中受擾動(dòng)流影響的相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。YAP 是一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，是由血管炎性細(xì)胞因子或振蕩剪切應(yīng)力（OSS）誘導(dǎo)的白細(xì)胞-EC 粘附的關(guān)鍵介質(zhì)，對(duì)血管炎性反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化至關(guān)重要。

基于此，復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院孟丹教授團(tuán)隊(duì)與復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院余波教授團(tuán)隊(duì)合作在Circulation Research期刊發(fā)表了題為“Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation”的研究成果。該研究旨在檢測內(nèi)皮細(xì)胞 BACH1 在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用，利用生成的EC 特異性 Bach1 敲除小鼠，觀察到 Bach1 的缺失抑制了小鼠血管炎癥并減輕了湍流或西方飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化。基于研究結(jié)論，將 BACH1 確定為內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的一種新型調(diào)節(jié)因子。

首先，為了支持 BACH1 在動(dòng)脈粥樣硬化中的潛在重要作用，研究人員分別證明了從有腦血管癥狀（短暫性腦缺血發(fā)作、一過性黑朦或中風(fēng)）的患者中獲得的頸動(dòng)脈斑塊中 BACH1 轉(zhuǎn)錄物的上調(diào)以及在ApoeKO高脂血癥小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化 AA 內(nèi)皮中也觀察到 BACH1 表達(dá)的增加。這些結(jié)果提示，內(nèi)皮細(xì)胞 BACH1 可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

為了研究不同的血流模式是否在體外調(diào)節(jié) BACH1 表達(dá)中發(fā)揮作用，測量了受振蕩流（OSS，± 4 dynes/cm2，1Hz，6/24h）的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中的 BACH1 蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與層流剪切應(yīng)力相比，暴露于 OSS 的 HUVECs 中 BACH1 表達(dá)和核定位增加。然后，研究了 BACH1 是否介導(dǎo)了OSS 下 ECs 的促炎反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)OSS 上調(diào)了粘附分子 （ICAM1、VCAM1）的水平，而 BACH1 的敲低減弱了這種反應(yīng)。

同時(shí)，構(gòu)建了內(nèi)皮特異性 Bach1 ECKO缺失小鼠，在高膽固醇飲食 4 周后通過部分結(jié)扎左頸動(dòng)脈在體內(nèi)探索OSS 相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化是否由內(nèi)皮 BACH1 介導(dǎo)，正如預(yù)期，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Bach1 ECKO小鼠在4 周后斑塊形成減少。這些結(jié)果確定了BACH1 是血流紊亂相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化的潛在介質(zhì)。

為了探討B(tài)ACH1 在高膽固醇血癥小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變形成中的作用，用AAV8-PCSK9D377Y  感染Bach1 ECKO小鼠和Bach1 WT對(duì)照小鼠。與 WT 對(duì)照相比，Bach1 ECKO降低了雄性和雌性小鼠主動(dòng)脈中的油紅 O 染色（圖1 A、B），兩者均表現(xiàn)出位于 AA 和胸主動(dòng)脈（TA）處的病變減少（圖1 C）。組織學(xué)分析表明，Bach1 ECKO減小了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的大?。▓D1 D），且主動(dòng)脈根部切片病變內(nèi) Mac3⁺ - 巨噬細(xì)胞的數(shù)量減少（圖1 E）。經(jīng)過 12 周的高膽固醇飲食，Bach1 ECKO小鼠血漿 TNF-α 和 IL-1β 水平顯著降低（圖1 F）。這些數(shù)據(jù)表明，Bach1 的缺失減輕了雄性和雌性小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變。

圖1    內(nèi)皮細(xì)胞特異性缺失Bach1改善西方飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化。

單核細(xì)胞對(duì)ECs 的粘附是動(dòng)脈粥樣硬化的初始步驟。因此，接下來研究了 EC-BACH1 在單核細(xì)胞粘附中的作用。值得注意的是，在小鼠和人類細(xì)胞中均觀察到EC-Bach1 的缺失降低了單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，而BACH1 的過表達(dá)增強(qiáng)了雙方的粘附作用。

進(jìn)一步地，在 ECs 中進(jìn)行了 BACH1 功能喪失或功能獲得，并檢測了粘附分子、促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低 BACH1 降低了 TNF-α誘導(dǎo)的粘附分子（ICAM1 和 VCAM1）和趨化因子（MCP1和 CCL5）在 HUVCEs 中的表達(dá)。與體外發(fā)現(xiàn)一致，與 WT 小鼠相比，Bach1 ECKO 小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變和ECs中 ICAM1 和 VCAM1 表達(dá)顯著降低。內(nèi)皮 Bach1 的缺失也減弱了 TNF-α誘導(dǎo)的Bach1 ECKO小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子和趨化因子（Mcp1和Ccl5）的mRNA表達(dá)。這些結(jié)果表明，BACH1 通過促進(jìn)單核細(xì)胞-內(nèi)皮粘附以及粘附分子和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)參與動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)。

為了探索 BACH1 是否與 YAP 相互作用，進(jìn)行了免疫共沉淀測定，進(jìn)一步證實(shí)了生理?xiàng)l件下BACH1 與 YAP 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的共定位。此外，觀察到 TNF-α 以時(shí)間依賴性方式增加 ECs 中 BACH1 和 YAP 的蛋白水平，促進(jìn)了兩者之間的相互作用，并增加其在 ECs 中的核定位。當(dāng) HUVECs 暴露于 OSS 時(shí)，也觀察到 ECs 中 BACH1 和 YAP 的核定位增加。ChIP-qPCR 檢測證實(shí)了 BACH1 和 YAP 均與 ICAM1 和 VCAM1 的啟動(dòng)子結(jié)合。TNF-α 刺激增強(qiáng)了 BACH1 和 YAP 對(duì)這些基因啟動(dòng)子的富集。這些數(shù)據(jù)表明，BACH1 是 YAP 的轉(zhuǎn)錄相互作用伴侶，TNF-α 促進(jìn) BACH1 和 YAP 的核積累，增加它們對(duì)粘附分子啟動(dòng)子的募集，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)粘附分子在 ECs 中的轉(zhuǎn)錄。

在 YAP 基因啟動(dòng)子區(qū)域鑒定出 BACH1 結(jié)合位點(diǎn)（圖2 A），因此研究假設(shè) BACH1 可能與 YAP 的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合并調(diào)節(jié) YAP 表達(dá)，觀察到 ECs 中BACH1 過表達(dá)顯著增加YAP 表達(dá)，而 BACH1 敲低減少YAP 表達(dá)（圖2 B）。此外，BACH1 過表達(dá)增強(qiáng)，其敲低降低 YAP mRNA 水平和啟動(dòng)子活性（圖2 C）。ChIP-qPCR 檢測證實(shí)了 BACH1 與 ECs 中的 YAP 啟動(dòng)子結(jié)合（圖2 D）。BACH1 過表達(dá)增加了 YAP 熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體的活性，但不影響含有BACH1結(jié)合位點(diǎn)突變的YAP熒光素酶報(bào)告基因（圖2 E）。這些數(shù)據(jù)表明，BACH1 與 YAP 啟動(dòng)子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄。

然后，研究又探討了 TNF-α誘導(dǎo)的 YAP 核積累是否依賴于 BACH1。正如預(yù)期，敲低 BACH1 降低了 TNF-α誘導(dǎo)的 YAP 蛋白表達(dá)（圖2 F），降低了 YAP 核定位（圖2 G），并在 TNF-α刺激后減少了 YAP 對(duì) ICAM1 和 VCAM1 基因的富集（圖2 H）。與體外結(jié)果一致，與WT小鼠相比，Bach1 ECKO小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變中內(nèi)皮細(xì)胞YAP的表達(dá)降低（圖2 I）。

圖2    BACH1 結(jié)合到Y(jié)AP啟動(dòng)子上激活其轉(zhuǎn)錄。

最后，研究探討了YAP 過表達(dá)是否可以在體內(nèi)消除 Bach1 缺失介導(dǎo)的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。實(shí)驗(yàn)觀察到，Bach1 ECKO 小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變面積、ICAM1和斑塊內(nèi)膜巨噬細(xì)胞浸潤（圖3 A-C）以及血漿IL-1β水平（圖3 D）均顯著降低，而YAP過表達(dá)的Bach1 ECKO小鼠則沒有顯著降低。這表明，EC 特異性 YAP 過表達(dá)在體內(nèi)抵消了 Bach1 缺失介導(dǎo)的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

此外，與健康主動(dòng)脈相比，BACH1 和 YAP 在有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的人主動(dòng)脈內(nèi)膜中高表達(dá)（圖3 E），且觀察到共定位（圖3 E）。同時(shí)，BACH1 的 mRNA 表達(dá)與人頸動(dòng)脈斑塊中的 YAP、ICAM1、IL-1β、VCAM1 和 CCL5 呈正相關(guān)（圖3 F）。

進(jìn)一步地，為了探究現(xiàn)有的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物是否抑制 BACH1 表達(dá)，研究人員還測試了幾種藥物，發(fā)現(xiàn)他汀類藥物降低了 BACH1 mRNA 水平，尤其是瑞舒伐他?。≧osuvastatin）。瑞舒伐他汀在 TNF-α刺激后顯著降低 BACH1 和 YAP 表達(dá)，并減弱 TNF-α誘導(dǎo)的 ICAM1 和 VCAM1 表達(dá)。但是，瑞舒伐他汀未能抑制 BACH1 誘導(dǎo)的粘附分子和趨化因子的表達(dá)，在 TNF-α刺激下，BACH1 敲低的 HUVECs中粘附分子和趨化因子的減少也不受瑞舒伐他汀的顯著影響。

為了進(jìn)一步測試瑞舒伐他汀是否影響體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化易感內(nèi)皮中 BACH1 的表達(dá)，用 AAV8-PCSK9D377Y 感染 WT 雄性小鼠，喂食8 周西方飲食，然后胃內(nèi)給藥瑞舒伐他汀持續(xù)2 周。與體外研究結(jié)果一致，瑞舒伐他汀顯著降低動(dòng)脈粥樣硬化敏感的 AA 內(nèi)皮細(xì)胞中 BACH1 和 YAP 的表達(dá)，還減弱了 ICAM1、IL-1β 和 CCL5 的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，瑞舒伐他汀抑制BACH1 可能參與了抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

圖3    內(nèi)皮細(xì)胞特異性YAP 過表達(dá)可抵消BACH1 缺失介導(dǎo)的體內(nèi)抗動(dòng)脈硬化作用。

圖4    圖形概要

BACH1 是內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵介質(zhì)。在血流受干擾或 TNF-α刺激后，BACH1 和 YAP 被誘導(dǎo)并易位到 ECs 的細(xì)胞核中。BACH1 通過與 YAP 啟動(dòng)子結(jié)合來上調(diào) YAP 表達(dá)，BACH1 與 YAP 形成復(fù)合物，誘導(dǎo)促炎基因的轉(zhuǎn)錄。瑞舒伐他汀通過降低 BACH1 的表達(dá)減輕內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化。

綜上所述，該研究結(jié)果表明，BACH1 作為新的血流動(dòng)力學(xué)機(jī)械傳感器，激活內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。此外，BACH1-YAP 轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)在促進(jìn)內(nèi)皮炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化生成方面至關(guān)重要。他汀類藥物對(duì) BACH1 的抑制作用使 BACH1 成為一種治療動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Jia M, Li Q, Guo J, Shi W, Zhu L, Huang Y, Li Y, Wang L, Ma S, Zhuang T, Wang X, Pan Q, Wei X, Qin Y, Li X, Jin J, Zhi X, Tang J, Jing Q, Li S, Jiang L, Qu L, Osto E, Zhang J, Wang X, Yu B, Meng D. Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation. Circ Res. 2022 Apr;130(7):1038-1055. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.319540. Epub 2022 Feb 24. PMID: 35196865.

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