在園藝和植物科學(xué)領(lǐng)域，延長花卉的花期一直是研究的熱點和挑戰(zhàn)。近期，一項關(guān)于日本牽牛花花期延長的研究引起了廣泛關(guān)注。研究團(tuán)隊使用AlphaScreen技術(shù)建立了一個高通量篩選系統(tǒng)，對一個包含9,600種化合物的文庫進(jìn)行了篩選，以尋找能夠抑制EPH1-DNA相互作用的化合物，通過篩選成功地發(fā)現(xiàn)了兩種抑制花瓣衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子EPH1的DNA結(jié)合活性的化合物，從而顯著延長了花卉的花期。

EPH1是一個NAM/ATAF1,2/CUC2（NAC）轉(zhuǎn)錄因子，是花瓣衰老過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對花瓣衰老過程中的程序性細(xì)胞死亡（PCD）起著關(guān)鍵作用。

研究人員首先合成了帶有C末端AGIA標(biāo)簽的EPH1蛋白，并確定了EPH1與其靶標(biāo)DNA（VPE序列）的結(jié)合。通過AlphaScreen技術(shù)，他們檢測到了EPH1與VPE DNA之間的強(qiáng)烈信號，而與突變的VPE DNA（mVPE）的結(jié)合則產(chǎn)生了很低的信號，表明該系統(tǒng)能夠有效地檢測EPH1與特定DNA序列的相互作用。

圖1：EPH1與DNA相互作用的高通量分析系統(tǒng)的建立以及EPH1抑制劑的篩選流程。使用AlphaScreen技術(shù)，用于檢測使用AGIA標(biāo)記的EPH1蛋白與生物素標(biāo)記的其靶標(biāo)DNA之間的作用。

接著，研究人員利用這一系統(tǒng)對一個包含9,600種化合物的文庫進(jìn)行了篩選，以尋找能夠抑制EPH1-DNA相互作用的化合物。他們發(fā)現(xiàn)了Everlastin1和Everlastin2，這些化合物能夠抑制EPH1與DNA的結(jié)合，并顯著延遲花瓣的衰老。通過進(jìn)一步的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)這些化合物通過抑制EPH1的二聚化來發(fā)揮作用，從而阻止了EPH1與DNA的結(jié)合。

圖2：第一輪篩選中得到的化合物結(jié)果：G1、G2和G3類似物的抑制EPH1-DNA相互作用活性的測試結(jié)果，化合物對花瓣衰老的影響，以及它們對花瓣蛋白含量的影響。

圖3：AlphaScreen技術(shù)檢測Everlastin1和Everlastin2對EPH1與DNA相互作用及對EPH1蛋白二聚化的影響的影響：EPH1全長蛋白（EPH1-FL）與VPE DNA的相互作用的影響，EPH1 DNA結(jié)合域（EPH1-DBD）與VPE DNA的相互作用的影響。

通過RNA測序分析顯示，這些化合物的處理強(qiáng)烈抑制了與程序性細(xì)胞死亡和自噬相關(guān)的基因表達(dá)。這些結(jié)果表明，針對轉(zhuǎn)錄因子的化學(xué)方法可以調(diào)節(jié)花瓣衰老，為延長觀賞植物的花期提供了新的化學(xué)策略。

圖4：Everlastin1和Everlastin2處理的花瓣的染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和轉(zhuǎn)錄組分析：使用抗EPH1抗體進(jìn)行的ChIP-qPCR分析，以及Everlastin1處理對基因表達(dá)的影響。

研究人員通過體外實驗和生物測定，進(jìn)一步證實Everlastin1和Everlastin2處理能夠延遲花瓣衰老的進(jìn)程，驗證了這些化合物在延遲花瓣衰老方面的效果，這一發(fā)現(xiàn)不僅為理解植物花瓣衰老的分子機(jī)制提供了新的見解，而且為開發(fā)延長觀賞植物花期的化學(xué)制劑提供了可能。

圖5：Everlastin1和Everlastin2對花瓣衰老的影響。圖中展示了這些化合物對花瓣可見衰老的時間進(jìn)程、蛋白含量、DNA降解以及花瓣面積的影響。

進(jìn)一步分析與應(yīng)用：研究還探討了這些化合物可能對其他轉(zhuǎn)錄因子（如NAC TFs）的影響，并提出了進(jìn)一步研究這些基因以增強(qiáng)對花瓣衰老分子機(jī)制的理解。此外，研究團(tuán)隊還考慮了這些化合物可能對其他轉(zhuǎn)錄因子和/或過程的影響及其在農(nóng)業(yè)和園藝領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用中的潛力，如通過噴灑或浸泡處理來延長盆栽或切花的花期。

在這項研究中，瑞孚迪（Revvity）公司的先進(jìn)技術(shù)和儀器發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

瑞孚迪的高通量篩選系統(tǒng)

利用Envision多功能酶標(biāo)儀搭配AlphaScreen技術(shù)檢測。

Flexdrop納升級分液器用于384孔AlphaPlate液體分配。

研究團(tuán)隊利用瑞孚迪的高通量篩選系統(tǒng)，對9,600種合成的化合物進(jìn)行了篩選，尋找到了目標(biāo)化合物。瑞孚迪高通量篩選系統(tǒng)的高效性和精確性為研究提供了強(qiáng)有力的支持，確保了篩選過程的準(zhǔn)確性和可靠性。通過這一系統(tǒng)，研究團(tuán)隊成功地識別出了能夠顯著延遲花瓣衰老的化合物，為后續(xù)的實驗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)于Envision多功能酶標(biāo)儀

更快的速度、通量和靈敏度

EnVision多模式微孔板檢測儀具有更快的速度、更高通量和所有檢測技術(shù)中的上佳靈敏度。作為高通量篩選的金標(biāo)準(zhǔn)，EnVision微孔板檢測儀以更高靈敏度和通量，始終如一地為您提供強(qiáng)大的檢測性能和穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)。

集多項成熟技術(shù)于一身

標(biāo)準(zhǔn)EnVision系統(tǒng)可檢測所有傳統(tǒng)檢測技術(shù)：

吸光度

熒光強(qiáng)度

化學(xué)發(fā)光，包括輝光型化學(xué)發(fā)光、閃光性化學(xué)發(fā)光和雙報告基因化學(xué)發(fā)光

時間分辨熒光(TRF)和TR-FRET，包括我們的DELFIA、LANCE和LANCE Ultra技術(shù)，以及HTRF®和LanthaScreen™

熒光偏振

提高性能、容量和通量

我們的 AlphaScreen®和AlphaLISA®激光檢測

技術(shù)，包括 AlphaPlex™

超靈敏化學(xué)發(fā)光

TRF激光檢測模塊

四光柵模塊

關(guān)于AlphaScreen技術(shù)

在確認(rèn)化合物活性時，AlphaScreen技術(shù)在這項研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這一技術(shù)能夠精確檢測化合物對EPH1與DNA相互作用的影響，確保篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。AlphaScreen技術(shù)是一種基于微珠的非放射性檢測方法，它具有多種優(yōu)勢，在蛋白質(zhì)相互作用檢測領(lǐng)域中比其他技術(shù)更為有效和方便：

高靈敏度：AlphaScreen技術(shù)利用供體和受體珠子之間的近距離相互作用產(chǎn)生信號，這種相互作用可以在非常低的濃度下檢測到，因此具有很高的靈敏度。

高通量：可以在微孔板格式中進(jìn)行，因此適合自動化和高通量篩選，這對于藥物發(fā)現(xiàn)和化合物庫篩選尤為便利高效。

寬動態(tài)范圍：檢測從皮摩爾到微摩爾范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度，這使得它能夠適應(yīng)不同的實驗條件和樣品濃度。

高數(shù)據(jù)質(zhì)量：利用時間分辨檢測來區(qū)分特異性信號和背景信號，這有助于提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。

適用性廣泛：可檢測多種類型的分子相互作用，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-小分子等，樣本包括細(xì)胞裂解物、血清、血漿、體液等生物學(xué)粗提取，而不會影響測讀效果，這使得它在生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究及藥物研發(fā)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。

高度靈活性：可以與各種生物分子標(biāo)簽兼容，如生物素、鏈霉親和素、抗體等，這增加了實驗設(shè)計的靈活性。

關(guān)于FlexDrop納升級分液系統(tǒng)

在文中提到的高通量篩選中，使用了瑞孚迪公司的FlexDrop儀器來分配試劑，將蛋白、抗體及微珠等精確地分配到384孔AlphaPlate中，以進(jìn)行高通量篩選。

FlexDrop的使用大大提高了篩選過程的自動化程度，確保了試劑分配的精確性和重復(fù)性，這對于高通量篩選實驗的成功至關(guān)重要。研究人員能夠高效地測試大量候選化合物，以尋找潛在的EPH1-DNA相互作用抑制劑。

FlexDrop特點及應(yīng)用：

96源孔+獨立控制的8正壓通道

精準(zhǔn)分液，每個脈沖產(chǎn)生一個8-50 nL微滴

內(nèi)置微滴檢測系統(tǒng)，每個微滴計數(shù)和監(jiān)測

死體積<1 uL，減少試劑浪費

FlexDrop在多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用：

基因組學(xué)及蛋白組學(xué)，藥物篩選，試劑開發(fā)，NGS文庫制備，PCR體系構(gòu)建，化合物分配，細(xì)胞分液，高通量篩選，免疫分析，昂貴試劑的加液…