巨噬細胞在宿主防御和免疫過程中發(fā)揮著至關重要的作用。在不同的微環(huán)境中，靜息巨噬細胞極化為M1（促炎）或M2（抗炎）巨噬細胞。M1巨噬細胞在感染或組織損傷期間會被脂多糖 （LPS） 激活，它們產生多種促炎細胞因子以及免疫反應。通過分子生物學方法可以研究巨噬細胞不同狀態(tài)。然而，巨噬細胞在活體內動態(tài)變化的行為仍然知之甚少。因此，開發(fā)活化的M1巨噬細胞高度特異性的探針，能夠更好地了解巨噬細胞的功能和動力學以及炎癥條件下治療干預的細胞反應。

M1巨噬細胞進行代謝重新編程，增強糖酵解，以促進細胞因子產生增加，響應炎癥信號。尋找能夠介導巨噬細胞中糖酵解和M1極化的新靶點成為新成像技術發(fā)展的關鍵。N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）是離子型谷氨酸受體，主要作用是控制中樞神經系統(tǒng)的突觸可塑性。它們在學習、記憶和神經元成熟中起著重要作用。然而各種類型的人類癌癥和巨噬細胞中檢測到NMDAR的證據也越來越多，如NMDAR受體介導的鈣信號通路產生活性氧（ROS），導致巨噬細胞中COX-2表達增強。這也提示NMDAR如何在M1巨噬細胞極化中發(fā)揮作用，以及它們是否可以應用于監(jiān)測各種炎癥性疾病的炎癥反應是值得研究的。

首先，研究人員發(fā)現NMDAR在LPS處理的巨噬細胞中過表達，隨后誘導M1巨噬細胞極化。從機制上講，NMDAR介導Ca2+的積累，從而參與到LPS通過上調PI3K/AKT/mTORC1信號傳導進行糖酵解。

基于NMDARs在M1巨噬細胞極化中的生物學相關性，研究人員認為NMDARs可以成為炎癥性疾病中M1巨噬細胞分布動態(tài)可視化的重要靶標。通過引入NMDAR抗體和紅外熒光染料FSD Fluor™ 647，制備了NMDAR靶向成像探針NMDAR-FSD Fluor 647簡稱為N-TIP。同時，為了進行特異性研究也制備了同型對照兔IgG單克隆Isotype-FSD Fluor™™ 647簡稱為I-TIP。

借助Operetta CLS的40倍水鏡進行Z軸掃描，并利用Harmony 4.9軟件進行3D重建和數據分析，建立體外分析方案。采用基于這種3D的成像技術，能夠可視化成像探針的細胞表面結合來確定N-TIP在LPS刺激的BMDM（鼠骨髓來源巨噬細胞）細胞膜上的功能結合（下圖）。使用這種基于3D的成像方法，我們可以清楚地識別測試細胞的細胞膜（綠色）、細胞核（藍色）、細胞質（白色）和特異性結合損傷的I-TIP或N-TIP（紅色）。當應用I-TIP時，在完整的BMDM和LPS刺激的BMDM中無法檢測到紅色信號。然而，在完整BMDM和LPS刺激的BMDM中都觀察到N-TIP結合損傷（紅色信號）。而且，LPS刺激的BMDM中的紅色信號明顯高于完整BMDM。隨后，研究人員也用流式進行了驗證。

基于N-TIP與M1極化巨噬細胞選擇性結合的發(fā)現，接下來評估了使用N-TIP作為活體小鼠炎癥反應的新型顯像劑的可行性。對于炎癥模型，采用了LPS誘導的炎癥和CG誘導的炎癥，這在一些炎癥研究中被廣泛用。

LPS炎癥誘導后，通過靜脈注射給予小鼠N-TIP，并在時間測量體內熒光。正如預期的那樣，在注射N-TIP后5小時，LPS注射的爪子中顯示發(fā)炎的病變，但在PBS注射的爪子中沒有。LPS誘導的發(fā)炎病變可觀察到至24h。然而，當應用I-TIP時，對照爪和LPS注射爪之間的FL信號沒有差異。

同樣，在CG誘導的炎癥的情況下，可以首先使用N-TIP在炎癥后5小時檢測發(fā)炎的病變，并持續(xù)到24小時。I-TIP無法區(qū)分對照和發(fā)炎病變。我們進一步使用IVISense Cat B 680 FAST（一種用于檢測炎癥病變巨噬細胞的探針）和N-TIP進行了體內成像研究。用N-TIP觀察到的發(fā)炎病變與用IVISense Cat B 680 FAST觀察到的病變相當，這表明NMDAR-flour 647可用于追蹤促炎性巨噬細胞。

之后，研究人員探討N-TIP介導的巨噬細胞成像方法是否具有評估抗炎劑在活體小鼠中的治療效果的潛力。選取在臨床前和臨床中已被廣泛用于治療炎癥性疾病的DEX作為研究對象。建立CG誘導的炎癥，然后通過腹腔注射進行DEX治療，以評估DEX的治療效果。在炎癥誘導后長達24小時的發(fā)炎病灶中檢測到強熒光信號。與對照小鼠相比，DEX處理顯著降低了發(fā)炎病變的熒光信號。進一步證實了N-TIP的生物分布。與體內研究結果一致，體外成像顯示CG注射的爪子中存在強烈的熒光信號且DEX處理的小鼠的顯著減少。

以上結果表明NMDAR介導的糖酵解在M1巨噬細胞相關炎癥中起著關鍵作用。并且，基于NMDAR開發(fā)的靶向成像探針可能有助于體內炎癥反應的研究。瑞孚迪的高內涵和活體成像的技術，提供給研究人員新的研究工具，從而在體外和活體內對相關探針的效果進行全面評價。