在科學(xué)研究中，細(xì)胞遷移和侵襲是理解生物體內(nèi)許多重要過(guò)程的關(guān)鍵。本期文章深入探討了常用的檢測(cè)方法：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 遷移/侵襲實(shí)驗(yàn)。一起來(lái)看下吧~

我的"寶貝"細(xì)胞終于養(yǎng)好了，導(dǎo)兒說(shuō)做遷移和侵襲試試，一頭霧水......

莫慌，遷移和侵襲可是大有不同！小 M 整理的這篇“干貨”涵蓋了基礎(chǔ)講解，實(shí)驗(yàn)操作，以及常見(jiàn)問(wèn)題解答，包會(huì)的！

01
遷移VS侵襲,大不同！

細(xì)胞遷移

細(xì)胞遷移 (又稱“細(xì)胞爬行、細(xì)胞移動(dòng)或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)”) 是細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到其他物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。細(xì)胞伸出頭部偽足并建立新的黏附，通過(guò)收縮細(xì)胞體尾部在時(shí)空上交替的過(guò)程。

遷移是活細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動(dòng)形式，胚胎發(fā)育、傷口愈合、免疫應(yīng)答、組織重塑等重要生命活動(dòng)過(guò)程都涉及細(xì)胞遷移^[1][2]。

圖 1. 細(xì)胞遷移的示意圖^[3]。 

細(xì)胞侵襲

細(xì)胞侵襲是入侵的細(xì)胞 (如癌細(xì)胞) 分泌蛋白酶降解胞外基質(zhì)層 (ECM) 或基底膜基質(zhì)層 (BME)，穿透基質(zhì)或組織進(jìn)入血管和淋巴管，從一個(gè)區(qū)域侵入到另一個(gè)區(qū)域的過(guò)程。

侵襲常發(fā)生于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等過(guò)程中，是細(xì)胞遷移的一種特殊形式^[2]。

  Tips：

• 侵襲是腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境發(fā)生多種變化的累積結(jié)果，這些變化使細(xì)胞能夠遷移并侵入健康的宿主組織。

• 當(dāng)增殖的腫瘤細(xì)胞試圖逃離原發(fā)腫瘤部位時(shí)，必須發(fā)生局部細(xì)胞粘附和周圍組織的侵襲。在穿透血管內(nèi)皮并進(jìn)入血流之前，癌細(xì)胞必須通過(guò)降解胞外基質(zhì)層 (ECM) 蛋白質(zhì)成分侵入局部組織，并最終穿過(guò)基底膜。一旦進(jìn)入血液循環(huán)，這些細(xì)胞就可以在次要位置形成轉(zhuǎn)移性集落。

細(xì)胞遷移和侵襲都是細(xì)胞在環(huán)境中移動(dòng)，依賴于細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)變化，且受到細(xì)胞外信號(hào) (如趨化因子、細(xì)胞因子等) 調(diào)控，與 ECM 的相互作用密切相關(guān)。但二者在機(jī)制、功能和意義方面有所區(qū)別。

02
細(xì)胞遷移檢測(cè)

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)可以揭示遷移機(jī)制，用于藥物篩選與評(píng)估。廣泛應(yīng)用于癌癥研究、傷口愈合、免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞遷移能力常見(jiàn)的方法。

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

  一、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，又稱“傷口愈合實(shí)驗(yàn)”，是一種經(jīng)典的檢測(cè)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法。

• 原理：在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中-央?yún)^(qū)域劃線，去除中-央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，依據(jù)劃痕邊緣細(xì)胞逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合的能力，判斷細(xì)胞生長(zhǎng)遷移能力^[5]。其可模擬傷口愈合過(guò)程，用于評(píng)估細(xì)胞在傷口處的遷移能力。

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：細(xì)胞、培養(yǎng)基、Transwell 小室或培養(yǎng)皿、劃痕工具 (無(wú)菌移液槍尖、劃痕刮刀或細(xì)胞劃痕器)、顯微鏡、合適的染色試劑 (如結(jié)晶紫或 DAPI)。

實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞以適宜的密度接種到培養(yǎng)皿或小室中進(jìn)行培養(yǎng)，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到 80%-90% 匯合狀態(tài)。
(2) 劃痕制備：使用無(wú)菌移液槍頭或劃痕器在細(xì)胞單層上輕輕劃出一道直線或網(wǎng)格狀傷口，確?？梢孕纬删鶆虻膭澓邸Ｔ趧澓厶?，盡量避免損傷周圍細(xì)胞，以減少對(duì)數(shù)據(jù)的干擾。
(3) 清洗細(xì)胞：輕輕用 PBS 沖洗細(xì)胞兩次，以去除游離的、未附著的細(xì)胞。
(4) 更換培養(yǎng)基：更換新鮮的培養(yǎng)基，保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性。
(5) 觀察劃痕愈合：用顯微鏡拍攝劃痕的圖像，記錄初始劃痕的狀態(tài) (T0)，隨后在 0、12、24、48 小時(shí)等不同時(shí)間點(diǎn)拍照，觀察劃痕的寬度或遷移的細(xì)胞數(shù)。

(6) 數(shù)據(jù)分析：使用圖像分析軟件 (如 ImageJ) 分析拍攝的圖像，測(cè)量劃痕的寬度，計(jì)算愈合面積。

注意事項(xiàng)

• 劃痕：劃痕時(shí)確保寬度一致，形狀盡量規(guī)則。

• 對(duì)照組：設(shè)置適當(dāng)?shù)膶?duì)照組 (如未處理組) 以便比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

• 顯微鏡觀察：定期拍照記錄，確保拍攝角度一致，以便于后期比較。

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

  二、Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)

Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)，又稱“穿孔實(shí)驗(yàn)”，是一種廣泛使用的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

• 原理：將小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液。將細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響^[9]。

圖 4. Transwell 遷移檢測(cè)的示意圖^[9]。 

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：Transwell 小室 (通常為 8 μm 的孔徑)、細(xì)胞、培養(yǎng)基、化學(xué)趨化因子、PBS、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色試劑 (如結(jié)晶紫、DAPI 或吉姆薩染色)、移液器和槍頭、顯微鏡。

實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞以適宜濃度接種于 Transwell 的上室中培養(yǎng)，直到細(xì)胞生長(zhǎng)到 70%-80% 匯合。
(2) 準(zhǔn)備下室：在下室中加入合適濃度的化學(xué)趨化因子 (如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子) 和培養(yǎng)基，建立化學(xué)梯度。
(3) 實(shí)驗(yàn)設(shè)置：可以設(shè)置對(duì)照組 (無(wú)趨化因子) 與實(shí)驗(yàn)組 (有趨化因子) 以比較細(xì)胞遷移能力的變化。
(4) 遷移實(shí)驗(yàn)：將 Transwell 小室置于培養(yǎng)箱中，一般孵育 24-48 小時(shí)，具體時(shí)間視細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，以促使?xì)胞向下室遷移。
(5) 清洗細(xì)胞：用 PBS 輕輕沖洗 Transwell 上室，以去除未遷移的細(xì)胞。沖洗通常進(jìn)行 2-3 次，減少背景噪聲。
(6) 固定細(xì)胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，常見(jiàn)的固定時(shí)間為 10-15 分鐘。固定結(jié)束后，用 PBS 沖洗細(xì)胞兩次，去除多余的固定液。
(7) 染色細(xì)胞：將染色劑 (如 0.1% 的結(jié)晶紫溶液) 加入 Transwell 的上室染色 20-30 分鐘。染色后，用 PBS 輕輕沖洗 2-3 次，以去除多余的染料。
(8) 觀察與計(jì)數(shù)：使用顯微鏡觀察 Transwell 膜，然后拍攝圖像。選擇隨機(jī)區(qū)域計(jì)數(shù)遷移到膜底部的細(xì)胞。根據(jù)各組遷移的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算遷移率。

圖 5. 人間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò) Transwell 小室遷移^[8]。

注意事項(xiàng)

• Transwell 系統(tǒng)：選擇合適的透膜孔徑 (通常 8 或 12 μm) 或膜材料。

• 細(xì)胞狀態(tài)：確保細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以確?；盍Ω哌m合遷移。

• 操作輕柔：在沖洗和固定細(xì)胞時(shí)，操作應(yīng)輕柔，以避免損傷已遷移的細(xì)胞。時(shí)間選擇：不同細(xì)胞系的遷移能力不同，因此需根據(jù)具體細(xì)胞的特性調(diào)整實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

02細(xì)胞侵襲檢測(cè)

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)可用于研究細(xì)胞穿透基質(zhì)或組織的能力，細(xì)胞侵襲性、揭示侵襲機(jī)制、藥物篩選與評(píng)估，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化的反應(yīng)。廣泛應(yīng)用于癌癥、創(chuàng)傷修復(fù)、免疫反應(yīng)和再生醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。
Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力常見(jiàn)的方法。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)

  三、Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)是一種廣泛用于評(píng)估細(xì)胞 (如腫瘤細(xì)胞) 侵襲能力的體外技術(shù)。

• 原理：與 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)類似，但不同的是，聚碳酸酯膜的上表面需涂布一層類似基質(zhì)的材料 (如 Matrigel 或膠原蛋白) 以模擬細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境，細(xì)胞會(huì)分泌酶類 (如基質(zhì)金屬蛋白酶, MMPs) 以降解基質(zhì)膠才能進(jìn)入下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞即可反映細(xì)胞的侵襲能力^[10]。該實(shí)驗(yàn)可了解細(xì)胞侵襲的調(diào)控機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：Transwell 小室 (通常 5 或 8 μm 孔徑)、基質(zhì)膠 (如 Matrigel 或膠原蛋白)、細(xì)胞系、培養(yǎng)基、化學(xué)趨化因子、PBS、甲醇或 4% 多聚甲醛、染色試劑 (如結(jié)晶紫、DAPI 或吉姆薩染色)、移液器和槍頭、顯微鏡。 

實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞以適宜濃度接種培養(yǎng)皿中，確保細(xì)胞生長(zhǎng)至 70%-80% 匯合。

(2) 準(zhǔn)備基質(zhì)膠：根據(jù)廠家的說(shuō)明書，在冰上將所需量的基質(zhì)膠 (Matrigel 或膠原蛋白) 溶解。在 Transwell 上室底部涂抹必要厚度的基質(zhì)膠 (通常為 50-100 μL)。在 4℃ 下孵育約 30 分鐘- 1 小時(shí)，以確?；|(zhì)膠固化。

(3) 準(zhǔn)備下室：在 Transwell 下室中加入合適濃度的化學(xué)趨化因子 (如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子) 和培養(yǎng)基。

(4) 遷移實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞 (通常為 1-2×10⁵ 個(gè)細(xì)胞) 懸浮于適宜的培養(yǎng)基中，并添加到 Transwell 上室中。在培養(yǎng)箱中孵育 24-48 小時(shí)，具體時(shí)間視細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，?xì)胞則向下室遷移和侵襲。

(5) 清洗細(xì)胞：用 PBS 輕輕沖洗 Transwell 上室，去除未侵襲的細(xì)胞。沖洗通常進(jìn)行 2-3 次，減少背景噪聲。

(6) 固定細(xì)胞：用甲醇或 4% 多聚甲醛在 Transwell 上室中固定細(xì)胞，固定時(shí)間 10-15 分鐘。固定結(jié)束后，用 PBS 沖洗細(xì)胞 2 次，去除多余的固定液。

(7) 染色細(xì)胞：將染色劑 (如 0.1% 結(jié)晶紫溶液) 加入 Transwell 上室染色 20-30 分鐘。用 PBS 輕輕沖洗 2-3 次，去除多余的染料。

(8) 觀察與計(jì)數(shù)：使用顯微鏡觀察 Transwell 膜，拍攝圖像。并選擇隨機(jī)區(qū)域計(jì)數(shù)侵襲到膜底部的細(xì)胞。根據(jù)各組侵襲的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算侵襲率。

圖 7. Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)中 Rac1 siRNA 抑制 SNB19 細(xì)胞通過(guò) Matrigel 的侵襲^[11]。 

注意事項(xiàng)

• 基質(zhì)膠的處理：基質(zhì)膠需在冰上處理，以保持其生物活性；鋪膠時(shí)，盡量垂直小室底部在小室底部中間加入，避免產(chǎn)生氣泡。

• 細(xì)胞狀態(tài)：確保細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以確?；盍Ω哌m合侵襲。

• 輕柔操作：在沖洗和固定細(xì)胞時(shí)，操作應(yīng)輕柔，避免損傷已侵襲的細(xì)胞。

• 觀察時(shí)間選擇：不同細(xì)胞系的侵襲能力不同，根據(jù)具體細(xì)胞的特性和對(duì)實(shí)驗(yàn)的預(yù)期效果調(diào)整實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

03
常見(jiàn)問(wèn)題及解答

? 為何實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞遷移不足？

答：可能的原因包括細(xì)胞狀態(tài)不處于健康生長(zhǎng)期、培養(yǎng)條件不具有適宜的培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子、基質(zhì)的厚度和成分不適合研究細(xì)胞遷移、實(shí)驗(yàn)環(huán)境不利于細(xì)胞遷移、孵育時(shí)間不充分等。
?  為什么細(xì)胞在 Transwell 實(shí)驗(yàn)中不能通過(guò)基質(zhì)？
答：可能的原因包括選擇的膜孔徑偏小、基質(zhì)膠或 Matrigel 的濃度過(guò)高、產(chǎn)生氣泡、缺少促進(jìn)細(xì)胞侵襲的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子、細(xì)胞傳代次數(shù)太多失去遷移活性、細(xì)胞系不適合等。
? 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中如何減少背景噪聲？
答：實(shí)驗(yàn)后使用PBS徹-底沖洗、使用適當(dāng)濃度的染料并控制染色時(shí)間、在固定和沖洗細(xì)胞時(shí)避免損傷細(xì)胞等。
? 如何選擇合適的細(xì)胞系進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)？

? 染色后細(xì)胞分布不均一可能原因？
答：Transwell 小室未平衡放置于孔板中、細(xì)胞懸液未混勻、小室發(fā)生傾斜或晃動(dòng)、小室的滲透膜不平等。
? Transwell 小室接種細(xì)胞的加液順序是什么？
答：先將完-全培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿或孔板中 (下室)，再輕輕將小室放入下室中。在放入時(shí)，建議將小室稍稍傾斜，一側(cè)先接觸液面，避免垂直放入產(chǎn)生氣泡。之后將混合均勻的細(xì)胞懸液加入小室內(nèi)部。

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