摘要

引言

材料與方法

植物材料與菌株

番茄遺傳轉(zhuǎn)化

1. 外植體準(zhǔn)備：取番茄種子，經(jīng) 70% 酒精消毒 30 秒、0.1%浸泡 8 分鐘，無菌水沖洗 5 次后，接種于 MS 基本培養(yǎng)基，25℃、16 小時光照 / 8 小時黑暗條件下萌發(fā)，待子葉展開、真葉初現(xiàn)，剪取子葉及下胚軸切段（0.5 - 1 cm）作外植體。

2. 農(nóng)桿菌侵染：挑取含重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌單菌落，接種于含相應(yīng)抗生素 YEB 液體培養(yǎng)基，28℃、200 rpm 振蕩培養(yǎng)至 OD??? = 0.6 - 0.8；收集菌體，用 MS 液體培養(yǎng)基重懸并調(diào) OD???至 0.4，加入乙酰丁香酮（100 μmol/L）提升轉(zhuǎn)化效率。外植體浸入菌液 15 分鐘，期間輕柔振蕩，確保侵染均勻。

3. 共培養(yǎng)與篩選再生：侵染后外植體轉(zhuǎn)至鋪有無菌濾紙的 MS 共培養(yǎng)基（含 2.0 mg/L 6 - BA、0.2 mg/L IAA），25℃暗培養(yǎng) 2 天促農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞互作；隨后移至篩選培養(yǎng)基（MS + 2.0 mg/L 6 - BA + 0.2 mg/L IAA + 50 mg/L 卡那霉素 + 250 mg/L 頭孢霉素），每 2 周繼代，誘導(dǎo)抗性愈傷、芽分化；待芽長至 2 - 3 cm，切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基（1/2 MS + 25 mg/L 卡那霉素）促生根，獲抗性植株。

分子生物學(xué)鑒定

1. PCR 檢測：以抗性植株葉片 DNA 為模板，利用特異性引物擴增抗菌肽 D 基因片段（引物序列：F：5’-ATGGCCTCGTGCTGCTGCTG-3’；R：5’-TCAGGGCTCGGTGGTGGTG-3’）。PCR 反應(yīng)體系 25 μL，含 1×PCR buffer、2.0 mmol/L MgCl?、0.2 mmol/L dNTPs、0.5 μmol/L 引物、1 U Taq DNA 聚合酶及約 100 ng 模板 DNA；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5 分鐘；94℃變性 30 秒，58℃退火 30 秒，72℃延伸 1 分鐘，35 個循環(huán)；72℃終延伸 10 分鐘。產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察，出現(xiàn)約 300 bp 條帶者初步判為陽性植株。

2. Southern 雜交：提取 PCR 陽性植株基因組 DNA，用限制性內(nèi)切酶 HindⅢ 酶切過夜，使基因組 DNA 片段化；經(jīng) 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳分離，堿變性、中和處理后，虹吸轉(zhuǎn)膜至尼龍膜；以標(biāo)記抗菌肽 D 基因全長探針（按 Roche 試劑盒操作），與膜雜交過夜，洗膜后用 CSPD 底物化學(xué)發(fā)光顯色，X 光 膠片曝光記錄，依雜交條帶數(shù)目、位置判定基因拷貝數(shù)，單拷貝整合植株用于后續(xù)研究。

3. RT - PCR 與 qRT - PCR：取轉(zhuǎn)基因及野生型番茄植株幼葉，用 TRIzol 試劑提取總 RNA，經(jīng) DNase I 消化去除殘留 DNA；取 1 μg RNA 用 M - MLV 反轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA。RT - PCR 引物同 PCR 檢測，內(nèi)參基因選 Actin（引物：F：5’-GCTGACAGGATGCAGAAGG-3’；R：5’-CTGGAAGGTGCTGAGGGAT-3’），擴增產(chǎn)物電泳分析基因轉(zhuǎn)錄情況。qRT - PCR 在 ABI 7500 實時熒光定量 PCR 儀進(jìn)行，反應(yīng)體系含 SYBR Green Master Mix、引物及 cDNA 模板，按 2?ΔΔCt 法計算抗菌肽 D 基因相對表達(dá)量，剖析不同株系表達(dá)差異。

表型鑒定

1. 生長發(fā)育觀測：將轉(zhuǎn)基因及野生型番茄幼苗移栽至溫室營養(yǎng)缽，基質(zhì)配比為草炭土∶蛭石∶珍珠巖 = 3∶1∶1，定期澆水、施肥，模擬自然生長環(huán)境；記錄植株株高、莖粗、葉片數(shù)、葉面積等形態(tài)指標(biāo)，自移栽起每周測量 1 次，持續(xù) 8 周；待植株開花結(jié)果，統(tǒng)計花期、坐果率、單果重等生殖參數(shù)，明確基因?qū)雽ιL發(fā)育全程影響。

2. 抗病性檢測：以灰霉病菌、青枯病菌為病原菌，采用離體葉片接種與盆栽植株灌根接種法。離體葉片接種時，摘取生長一致葉片，表面消毒后用無菌打孔器制成葉盤，葉盤背面接種 10 μL 濃度為 1×10? spores/mL 灰霉病菌孢子懸液，保濕培養(yǎng)，25℃、12 小時光照下觀察病斑擴展，48 小時后測量病斑直徑；盆栽植株灌根接種青枯病菌，待植株長至 6 - 8 葉期，每株灌施 50 mL 濃度 1×10? CFU/mL 菌液，接種后監(jiān)測發(fā)病癥狀，按病情分級標(biāo)準(zhǔn)（0 級：無癥狀；1 級：1/4 葉片萎蔫；2 級：1/2 葉片萎蔫；3 級：3/4 葉片萎蔫；4 級：全株死亡）記錄病情指數(shù)，評估抗菌肽 D 基因抗病效能。

3. 抗逆性評估：模擬干旱、鹽脅迫環(huán)境，干旱處理組停止?jié)菜镣寥老鄬拷抵?30%，維持 10 天；鹽脅迫組用 200 mmol/L NaCl 溶液澆灌，每周 3 次，持續(xù) 2 周；觀測植株萎蔫、黃化、壞死等表型，測定葉片相對含水量、脯氨酸含量、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性，從生理生化層面解析植株抗逆潛能變化。

結(jié)果與分析

番茄轉(zhuǎn)化植株獲得

分子鑒定結(jié)果

1. PCR 檢測：PCR 擴增產(chǎn)物電泳顯示，85 株呈現(xiàn)預(yù)期 300 bp 清晰條帶，初步陽性率達(dá) 85%，表明抗菌肽 D 基因已整合至多數(shù)番茄植株基因組；但 PCR 有假陽性可能，需結(jié)合 Southern 雜交精準(zhǔn)甄別。

2. Southern 雜交：對 PCR 陽性植株雜交分析，68 株顯雜交信號，單拷貝整合植株 42 株、雙拷貝 20 株、多拷貝 6 株；剔除多拷貝不穩(wěn)定株系，鎖定 42 株單拷貝整合植株，單拷貝利于基因穩(wěn)定表達(dá)、表型精準(zhǔn)預(yù)測，契合后續(xù)研究要求。

3. RT - PCR 與 qRT - PCR：RT - PCR 結(jié)果顯示，單拷貝整合轉(zhuǎn)基因植株均轉(zhuǎn)錄抗菌肽 D 基因，野生型無對應(yīng)條帶；qRT - PCR 定量表明，不同株系基因表達(dá)量差異顯著，最高表達(dá)株系是低株系 5.2 倍，為后續(xù)抗病表型關(guān)聯(lián)分析提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，暗示表達(dá)量或與抗病程度緊密掛鉤。

表型鑒定結(jié)果

1. 生長發(fā)育：連續(xù) 8 周生長監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株生長指標(biāo)與野生型相近，僅少數(shù)株系株高略降（降幅 5% - 10%）、葉面積稍??；花期、坐果率、單果重?zé)o顯著波動，說明抗菌肽 D 基因植入未對番茄核心生長發(fā)育進(jìn)程釀成嚴(yán)重干擾，基因安全性獲初步佐證。

2. 抗病性：離體葉片接種灰霉病菌 48 小時后，野生型葉盤病斑直徑達(dá) 15 - 20 mm，病斑蔓延迅速、菌絲密布；轉(zhuǎn)基因植株病斑直徑多控制在 5 - 10 mm，部分高表達(dá)株系僅 3 - 5 mm，病斑擴展減緩、菌絲生長受抑，抗菌效果斐然。盆栽灌根接種青枯病菌 14 天后，野生型病情指數(shù)飆升至 80%，近乎全株萎蔫死亡；轉(zhuǎn)基因植株病情指數(shù)介于 20% - 40%，植株維持生長，根系受損較輕，彰顯抗菌肽 D 基因在活體植株抗病、保產(chǎn)價值。

3. 抗逆性：干旱脅迫下，野生型植株葉片嚴(yán)重萎蔫、卷曲，相對含水量降至 40%；轉(zhuǎn)基因植株相對含水量維持 60% - 70%，脯氨酸積累量是野生型 2 - 3 倍，抗氧化酶活性顯著提升，協(xié)同減輕膜脂過氧化損傷。鹽脅迫時，野生型葉尖黃化、壞死，生長停滯；轉(zhuǎn)基因植株僅葉緣輕微失綠，新葉仍能伸展，植株耐受性增強，拓展番茄種植地域、環(huán)境適應(yīng)性。

討論

結(jié)論