摘要?
構(gòu)建陽離子聚合物/化學(xué)siRNA納米復(fù)合物，結(jié)合威尼德電穿孔儀優(yōu)化遞送程序，實(shí)現(xiàn)肝癌原代細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染。納米顆粒粒徑85.3±4.2 nm（PDI 0.18），轉(zhuǎn)染效率達(dá)89.7%±2.4（vs脂質(zhì)體法32.1%±5.6），細(xì)胞存活率93.5%±3.1。qPCR顯示VEGFA mRNA表達(dá)降低72.8%（p<0.001），為肝癌基因治療提供精準(zhǔn)遞送新方案。

?引言?

肝癌原代細(xì)胞因高異質(zhì)性、低分裂活性及致密胞外基質(zhì)，導(dǎo)致傳統(tǒng)siRNA遞送效率不足20%（Zhou et al., 2024）。化學(xué)合成siRNA雖可精確修飾硫代磷酸鍵增強(qiáng)穩(wěn)定性，但陽離子脂質(zhì)體遞送仍面臨溶酶體降解（>60% siRNA失活）與細(xì)胞毒性矛盾（Liu et al., 2025）。本研究創(chuàng)新性開發(fā)雙重遞送體系：①聚β氨基酯（某試劑）包載硫代修飾siRNA形成核殼納米粒；②威尼德電穿孔儀施加梯度電場（80-150 V）定向擊穿細(xì)胞膜屏障。

實(shí)驗(yàn)通過威尼德分子雜交儀構(gòu)建粒徑均一納米顆粒，透射電鏡證實(shí)其完整包封結(jié)構(gòu)。三維培養(yǎng)肝癌原代細(xì)胞模型顯示，聯(lián)合遞送組siRNA胞質(zhì)釋放效率較單一電穿孔提升2.7倍（共聚焦定量分析），且顯著降低LDH泄漏量至脂質(zhì)體組的41.3%（p<0.001）。

?材料與方法?

2.1 肝癌原代細(xì)胞分離與驗(yàn)證

取肝癌切除術(shù)新鮮組織（倫理批號(hào)HP2025-028），經(jīng)0.2%膠原酶Ⅷ（某試劑）37℃振蕩消化45分鐘，70μm濾網(wǎng)過濾后獲得活性>92%的細(xì)胞。采用CK18免疫熒光與GPC3流式檢測雙驗(yàn)證細(xì)胞純度（>95%），含10% FBS（某試劑）的DMEM培養(yǎng)基中形成三維腫瘤微球（直徑150-200 μm）。

2.2 siRNA納米復(fù)合物制備

 ?化學(xué)合成siRNA?：靶向VEGFA基因（NCBI: NM_001025366.3）設(shè)計(jì)硫代磷酸修飾siRNA
正義鏈：5'-CAGAUAUCAGACAUCCUGA-3'
反義鏈：5'-UCAGGAUGUCUGAUAUCUG-3'

 ?納米包載?：聚β氨基酯（某試劑）與siRNA按N/P=10混合，威尼德分子雜交儀50℃震蕩1小時(shí)，超濾離心去除游離siRNA。

2.3 電穿孔-納米遞送協(xié)同策略

?預(yù)加載處理?：納米復(fù)合物（50 μg/mL）與細(xì)胞共孵育2小時(shí)

?電場強(qiáng)化?：威尼德電穿孔儀施加雙脈沖（100 V，10 ms；間隔30 s）

?膜修復(fù)?：含5%海藻糖（某試劑）的恢復(fù)培養(yǎng)基處理4小時(shí)

2.4 功能評(píng)估

?轉(zhuǎn)染效率?：Cy3標(biāo)記siRNA流式定量，共聚焦觀察亞細(xì)胞分布

?基因沉默?：qRT-PCR檢測VEGFA mRNA，Western blot檢測蛋白表達(dá)

?細(xì)胞毒性?：CCK-8法檢測增殖活力，LDH試劑盒分析膜完整性

?結(jié)果?

3.1 遞送系統(tǒng)表征

?粒徑電位?：納米顆粒平均粒徑85.3±4.2 nm（PDI 0.18），Zeta電位+24.7 mV

?包封率?：高效液相色譜法測定siRNA包封率98.2%±0.6

?緩釋特性?：PBS中72小時(shí)累計(jì)釋放率82.4%±3.5

3.2 轉(zhuǎn)染效能分析

?效率與活性?：聯(lián)合組轉(zhuǎn)染效率89.7%±2.4，存活率93.5%±3.1（vs電穿孔單獨(dú)組75.2%±4.8）

?基因沉默?：VEGFA mRNA表達(dá)降低72.8%±4.1（p<0.001），蛋白水平下降67.3%±5.2

?功能抑制?：Transwell實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞侵襲數(shù)量減少58.4%±6.3（p<0.01）

?討論?

雙重遞送策略突破肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染瓶頸：①納米顆粒表面正電荷（+24.7 mV）增強(qiáng)細(xì)胞膜吸附，電脈沖促進(jìn)內(nèi)吞小泡膜破裂（K+泄漏量增加3.2倍）；②硫代修飾siRNA抵抗核酸酶降解，胞質(zhì)有效濃度提升至脂質(zhì)體組的4.1倍。相較于Zhang等（2025）的病毒-電穿孔聯(lián)用方案，本體系避免病毒載體插入突變風(fēng)險(xiǎn)，且將轉(zhuǎn)染周期縮短至6小時(shí)（原方案需48小時(shí)）。

?結(jié)論?

化學(xué)合成siRNA與電穿孔協(xié)同遞送體系顯著提升肝癌原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率至89.7%，VEGFA基因沉默率達(dá)72.8%，且維持93.5%細(xì)胞存活率。該技術(shù)為肝癌個(gè)體化基因治療提供新思路，下一步將開展PDX模型體內(nèi)療效驗(yàn)證。