EVA1A (Eva-1 Homolog A) Promotes Endothelial Apoptosis and Inflammatory Activation Under Disturbed Flow Via Regulation of Autophagy

Keywords: apoptosis; atherosclerosis; autophagy; endothelial cell; zebrafish.

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性動(dòng)脈疾病，血流施加在內(nèi)皮細(xì)胞上的血流動(dòng)力學(xué)壁剪切應(yīng)力（WSS）決定了動(dòng)脈粥樣硬化病變的空間分布。低 WSS 量級(jí)的反向擾動(dòng)流（DF）促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞（EC）炎癥和凋亡，推動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展，而單向且高 WSS 量級(jí)的 un-DF 具有動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用。

EVA1A（eva-1 同源物 A，也稱(chēng)為 FAM176A）最初被鑒定為一種溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白，與自噬體共定位并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬。研究已表明，EVA1A 在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮作用。小鼠心肌細(xì)胞特異性敲除 EVA1A 通過(guò)損害自噬導(dǎo)致快速心力衰竭。EVA1A 也可能參與斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，因?yàn)榕c無(wú)癥狀的人頸動(dòng)脈斑塊相比，在有癥狀的人類(lèi)頸動(dòng)脈斑塊中發(fā)現(xiàn) EVA1A mRNA 表達(dá)增加。然而，包括自噬調(diào)節(jié)作用在內(nèi)的潛在機(jī)制尚不清楚。

因此，英國(guó)謝菲爾德大學(xué)感染、免疫和心血管疾病系及倫敦帝國(guó)理工學(xué)院國(guó)家心肺研究所的科學(xué)家在一項(xiàng)研究中嘗試探索了 EVA1A 在 WSS 調(diào)控的內(nèi)皮功能障礙和血流暴露的 ECs 自噬調(diào)控中的作用。研究成果發(fā)表在 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“EVA1A (Eva-1 Homolog A) Promotes Endothelial Apoptosis and Inflammatory Activation Under Disturbed Flow Via Regulation of Autophagy”。

首先，在健康豬和小鼠的主動(dòng)脈中研究血流對(duì) EVA1A 表達(dá)的影響（圖1 A-C）。與外曲率和降主動(dòng)脈（未受擾動(dòng)流影響，UF 區(qū)域）相比，EVA1A 在主動(dòng)脈弓內(nèi)曲率（DF 區(qū)域）的 mRNA 和蛋白表達(dá)增加（圖1 B、C）。EVA1A 蛋白定位主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。然后，將EVA1A 暴露于流動(dòng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs），利用體外剪切力模型產(chǎn)生DF。DF 增加了 EVA1A mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平（圖1 D、E），且EVA1A 定位與在小鼠主動(dòng)脈中觀察到的相似。這些數(shù)據(jù)表明，EVA1A 的表達(dá)在體內(nèi)和體外均受 WSS 調(diào)節(jié)，并且受促動(dòng)脈粥樣硬化的 DF 誘導(dǎo)。

為了研究生理血流條件下 EVA1A 在人 EC 中的作用，使用 siRNA 在 HUVECs 中敲低 EVA1A，評(píng)估其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。與暴露于 UF 的 ECs相比，暴露于 DF 的 ECs 凋亡水平顯著增加。EVA1A 缺失使 DF 條件下的 EC 凋亡水平降低到與 UF 條件相當(dāng)?shù)乃?，表?EVA1A 在 DF 下促進(jìn) EC 細(xì)胞凋亡。

除了細(xì)胞凋亡外，內(nèi)皮細(xì)胞增殖失調(diào)也可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞周轉(zhuǎn)增加。因此，通過(guò)分析暴露于流動(dòng)或靜態(tài)條件下的 EVA1A 缺失型 ECs 中增殖標(biāo)志物 PCNA 的表達(dá)來(lái)檢測(cè) EVA1A 是否調(diào)節(jié) EC 增殖，發(fā)現(xiàn)在任何研究條件下，與對(duì)照細(xì)胞相比，敲低EVA1A 未觀察到 PCNA+ 增殖細(xì)胞比例的顯著差異。

由于細(xì)胞凋亡與血管滲漏有關(guān)，因此評(píng)估了 EVA1A 敲低對(duì) EC 通透性的影響。暴露于 DF 72 小時(shí)后，與對(duì)照細(xì)胞相比，EVA1A 缺失的 ECs Rd-白蛋白的滲透性較低。同時(shí)，與對(duì)照細(xì)胞相比，EVA1A基因敲低對(duì)靜態(tài)條件下細(xì)胞的通透性無(wú)顯著影響。

此外，還測(cè)量了 DF 誘導(dǎo)的幾種炎性細(xì)胞因子和粘附分子在 EVA1A 缺失型 ECs 中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在 DF 條件下，敲低 EVA1A 導(dǎo)致 SELE、VCAM1 和IL-8的 mRNA 水平顯著降低，而 ICAM1 表達(dá)降低的趨勢(shì)不顯著。然而，在 UF 或靜態(tài)條件下，EVA1A 缺失不會(huì)導(dǎo)致炎癥標(biāo)志物表達(dá)的變化，表明 EVA1A 對(duì)炎癥激活的影響取決于血流條件。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在 TNF 刺激的 ECs 中敲低 EVA1A 導(dǎo)致 DF 下單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附降低的趨勢(shì)，但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明 EVA1A 可能引發(fā)了ECs對(duì)單核細(xì)胞的粘附。

這些數(shù)據(jù)表明，EVA1A 介導(dǎo) DF 對(duì) EC 細(xì)胞凋亡和炎癥激活的影響，導(dǎo)致 EC 通透性增加。

圖1   EVA1A 是由豬、小鼠和人內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的促粥樣硬化剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的。

接下來(lái)，為了測(cè)試 EVA1A 在生理流動(dòng)條件下是否在 ECs 的自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，使用自噬溶酶體抑制劑巴弗洛霉素（Bafilomycin）測(cè)量了 EVA1A 沉默的 ECs 中的自噬通量。LC3-II和P62是自噬的標(biāo)志性蛋白。在沒(méi)有巴弗洛霉素的情況下，暴露于 DF 后，與對(duì)照組相比，EVA1A 缺失細(xì)胞中 LC3-II 表達(dá)有增加的趨勢(shì)，但并不顯著。然而，與對(duì)照 ECs 相比，使用巴弗洛霉素阻斷自噬通量導(dǎo)致 EVA1A -沉默的細(xì)胞中 LC3-II和 p62蛋白水平顯著富集，表明EVA1A 缺失的細(xì)胞中自噬通量增加。相比之下，在 UF 條件下，在存在或不存在巴弗洛霉素的情況下，EVA1A 敲低細(xì)胞和對(duì)照之間的 LC3-II 和 p62 水平?jīng)]有差異，表明 EVA1A 在 UF 條件下不調(diào)節(jié)自噬。

為了確定 EVA1A 是否通過(guò)調(diào)節(jié)自噬促進(jìn) DF 下的 EC 凋亡，評(píng)估了阻斷自噬通量對(duì) EVA1A-沉默細(xì)胞中細(xì)胞凋亡的影響（圖2 A、B）。EVA1A 沉默的對(duì)照細(xì)胞（DMSO處理）中 EC 細(xì)胞凋亡降低，這與 EVA1A 的促凋亡功能一致。然而，巴弗洛霉素處理恢復(fù)了 EVA1A 缺失型細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，使其達(dá)到與對(duì)照細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃剑▓D2 A、B）。同時(shí)，用巴弗洛霉素處理 DF 暴露的對(duì)照細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致 EC 細(xì)胞凋亡的顯著增加。這些數(shù)據(jù)表明，EVA1A 降低暴露于致動(dòng)脈粥樣硬化 DF 的 ECs 中的自噬通量，導(dǎo)致 EC 功能障礙。

致動(dòng)脈粥樣硬化 DF 的特征是低幅度 WSS 和 WSS 方向的變化。為了確定 DF 的這 2 種作用哪一種負(fù)責(zé) ECs 中的 EVA1A 誘導(dǎo)，使用了平行平板流動(dòng)系統(tǒng)（圖2 C）。有趣的是，與層流高WSS（13 dynes/cm2）相比，當(dāng) ECs 暴露于層流低 WSS（4 dynes/cm2）時(shí)未誘導(dǎo) EVA1A mRNA 表達(dá)，但當(dāng)暴露于低振蕩 WSS（LOSS，4 dynes/cm2，1 Hz）時(shí)其顯著上調(diào)。這表明，當(dāng) ECs 暴露于 DF 條件下時(shí)，是流向的擾動(dòng)，而不是 WSS 幅度，導(dǎo)致 EVA1A 上調(diào)。

TWIST1（人類(lèi)直系同源物為TWIST1）蛋白是一種進(jìn)化上高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，可被DF 激活并促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化，這使其成為DF 敏感調(diào)節(jié) EVA1A 的有力候選者。通過(guò)siRNA 敲低 ECs 中的 TWIST1 來(lái)測(cè)試 TWIST1 是否調(diào)控 EVA1A mRNA 表達(dá)（圖2 C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DF 條件下TWIST1 的缺失顯著降低 EVA1A mRNA 表達(dá)，表明 EVA1A 是 TWIST1 的下游靶點(diǎn)（圖2 D）。

圖2   EVA1A 通過(guò)調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

最后，為了測(cè)試 EVA1A 在體內(nèi) ECs 中的作用，建立了血流調(diào)控 EC 細(xì)胞凋亡的斑馬魚(yú)模型。在斑馬魚(yú)基因組中鑒定出兩個(gè) EVA1A 直系同源物Eva1a-1 和 Eva1a-2，發(fā)現(xiàn)Eva1a-1 在內(nèi)皮 GFP+ 細(xì)胞中不表達(dá)，而 Eva1a-2 存在于內(nèi)皮型 GFP+ 和非內(nèi)皮型 GFP+ 細(xì)胞中，且在后者中表達(dá)更高。因此，重點(diǎn)關(guān)注于 Eva1a-2 直系同源物在斑馬魚(yú)內(nèi)皮中的作用。

然后，注射Silent Heart（sih）（MO，可特異性敲低 Eva1a-2）來(lái)阻止血液循環(huán)（圖3）。血流停止顯著增強(qiáng)了 EC 細(xì)胞凋亡（圖3）。敲低 Eva1a 對(duì)在受精后 30 小時(shí)血流正常的胚胎中 EC 凋亡的基礎(chǔ)水平?jīng)]有顯著影響，而使血流停止誘導(dǎo)的 EC 凋亡降低了15%（圖3 A、B）。同時(shí)，在受精后 30 小時(shí)觀察到的每組 EC 總數(shù)沒(méi)有顯著差異，表明在 Eva1a 缺失的胚胎中觀察到的細(xì)胞凋亡減少不是數(shù)量改變的結(jié)果。因此，EVA1A 促進(jìn)斑馬魚(yú)胚胎在體內(nèi)血流停止（而非無(wú)血流）情況下EC細(xì)胞凋亡。

圖3   EVA1A 在斑馬魚(yú)體內(nèi)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

圖4    圖形概要

總之，該研究進(jìn)一步證明了 EVA1A 在豬和小鼠主動(dòng)脈以及人內(nèi)皮細(xì)胞中被促動(dòng)脈粥樣硬化 DF 上調(diào)了mRNA 和蛋白水平。從功能上講，在模擬人動(dòng)脈的 DF 條件下，EVA1A 促進(jìn)人 ECs 的凋亡并增加 ECs 通透性和炎癥激活。因此，EVA1A 介導(dǎo) DF 對(duì) ECs 功能障礙的影響，這先于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。從機(jī)制上講，在暴露于 DF 而不是 UF 的 ECs 中，EVA1A 有助于減少自噬通量，從而導(dǎo)致 ECs 凋亡增加。最后，研究證明， EVA1A 是由 WSS 方向的變化而不是幅度誘導(dǎo)的，并確定促動(dòng)脈粥樣硬化轉(zhuǎn)錄因子 TWIST1 是 EVA1A 的上游調(diào)節(jié)因子。未來(lái)有必要對(duì) EVA1A 功能進(jìn)行更詳細(xì)的分析，以更好地了解其在血管健康和疾病中的作用及其作為心血管疾病治療靶點(diǎn)的潛在用途。

參考文獻(xiàn)：Canham L, Sendac S, Diagbouga MR, Wolodimeroff E, Pirri D, Tardajos Ayllon B, Feng S, Souilhol C, Chico TJA, Evans PC, Serbanovic-Canic J. EVA1A (Eva-1 Homolog A) Promotes Endothelial Apoptosis and Inflammatory Activation Under Disturbed Flow Via Regulation of Autophagy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Apr;43(4):547-561. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318110. Epub 2023 Feb 16. Erratum in: Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Jun;43(6):e230. doi: 10.1161/ATV.0000000000000163. PMID: 36794585; PMCID: PMC10026973

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