ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）的底物顯色原理基于酶催化反應產(chǎn)生的顏色變化，通過這一變化實現(xiàn)對目標分子的定性或定量檢測。以下是其核心原理的詳細說明：

1. 基本流程
- 抗原-抗體結合：目標抗原被固定在固相載體（如微孔板）上，與特異性抗體結合。
- 酶標記抗體：通過直接或間接法（如二抗）引入酶標記的抗體（常用酶包括辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶AP等）。
- 底物反應：加入無色底物，酶催化底物分解，生成有色產(chǎn)物。

2. 顯色反應的關鍵步驟
(1) 酶的選擇與對應底物
- HRP（辣根過氧化物酶）：
- 底物：TMB（3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）、OPD（鄰苯二胺）、ABTS（2,2'-聯(lián)氮雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。
- 反應原理：在過氧化氫（H?O?）存在下，HRP催化底物氧化。
- 例如，TMB被氧化后生成藍色產(chǎn)物（最大吸收波長450 nm），加入硫酸終止反應后變?yōu)辄S色（吸收波長450 nm）。
- 特點：靈敏度高、反應快速，需酸性終止液。

- AP（堿性磷酸酶）：
- 底物：pNPP（對硝基苯磷酸酯）、BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氮藍四唑）。
- 反應原理：AP催化底物水解。
- pNPP水解生成黃色的對硝基苯酚（吸收波長405 nm）。
- BCIP/NBT生成藍色/紫色沉淀（適用于肉眼觀察或比色法）。
- 特點：反應較溫和，無需終止液，適合長時間孵育。


(2) 顏色變化的定量分析
- 顯色產(chǎn)物的吸光度（OD值）與目標分子濃度呈正相關，通過酶標儀測量特定波長下的吸光度值，繪制標準曲線即可實現(xiàn)定量分析。


3. 其他類型底物
除了顯色底物，ELISA還可使用以下底物系統(tǒng)：
- 熒光底物：酶催化底物生成熒光物質（如HRP催化Ampliflu Red），通過熒光酶標儀檢測。
- 化學發(fā)光底物：酶催化底物產(chǎn)生光信號（如HRP催化魯米諾），通過化學發(fā)光儀檢測，靈敏度更高。


4. 關鍵影響因素
- 酶活性：溫度、pH、抑制劑可能影響酶反應效率。
- 底物穩(wěn)定性：需避光保存（如TMB見光易分解）。
- 反應時間：顯色時間過長可能導致背景信號升高。


5. 應用場景
- 顯色底物（如TMB、pNPP）適用于常規(guī)ELISA檢測。
- 化學發(fā)光/熒光底物適用于高靈敏度檢測（如低豐度蛋白、細胞因子）。

通過這一原理，ELISA實現(xiàn)了對蛋白質、抗體、病毒等生物分子的高特異性檢測，廣泛應用于醫(yī)學診斷、生物研究和藥物開發(fā)領域。