一、知識(shí)背景

SP6核糖核酸聚合酶也被稱為SP6 RNA聚合酶，是一種由大腸桿菌中的噬菌體SP6產(chǎn)生的酶。這種酶具有在體外合成RNA分子的能力，因此，它常被用于體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，廣泛應(yīng)用于合成特定的RNA分子。

SP6核糖核酸聚合酶的主要特點(diǎn)是能夠高度特異識(shí)別SP6啟動(dòng)子序列，是一種DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。它催化單鏈或雙鏈DNA SP6啟動(dòng)子下游NTP的摻入，合成與SP6啟動(dòng)子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA。此外，SP6 RNA聚合酶還能識(shí)別修飾的NTP，例如生物素標(biāo)記、熒光素標(biāo)記的NTP，這使得它在各種標(biāo)記RNA的合成中具有應(yīng)用價(jià)值。

在科研實(shí)驗(yàn)中，利用SP6核糖核酸聚合酶合成的RNA有多種應(yīng)用，如制備雜交探針、進(jìn)行基因組DNA序列分析、核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定、反義RNA合成、作為體外翻譯的RNA模板、RNA剪接研究的底物、RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和RNA-蛋白質(zhì)相互作用研究，以及核酸擴(kuò)增分析等。此外，它還可以用于合成siRNA、miRNA等小RNA。

值得注意的是，使用SP6核糖核酸聚合酶時(shí)，必須以SP6 DNA或克隆在SP6啟動(dòng)子下游的DNA作為合成模板，并且該酶需要在特定的條件下儲(chǔ)存，一般是-20°C。

二、應(yīng)用研究

SP6核糖核酸聚合酶可以用于FasL基因的克隆化及其mRNA在肺癌組織中的表達(dá)分布：

通過采用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和分子克隆技術(shù)克隆人FasL基因片段，制備互補(bǔ)核糖核酸(cRNA)探針，采用原位雜交的方法觀察FasL mRNA在肺癌組織細(xì)胞中的表達(dá)分布情況，并探討其臨床意義。

方法：分離健康人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，終濃度為50mM，用植物血凝素-P(PHA-P)激活15分鐘，誘導(dǎo)FasL基因表達(dá)，用人全血總RNA提取試劑盒(QIAamp RNA Blood Mini kit)提取總RNA，特異性引物反轉(zhuǎn)錄制備互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增FasL基因片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，顯示在≈328bp處呈現(xiàn)1條與預(yù)期產(chǎn)物分子量大小相符的DNA擴(kuò)增條帶，按照QIAquick凝膠提取試劑盒說明進(jìn)行膠上PCR產(chǎn)物回收，予以擴(kuò)增、純化，用PstI、EcoRI雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pSPT19，使PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒DNA兩端互補(bǔ)，用T4連接酶將其定向克隆入質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，在涂抹有氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白篩選，獲取有重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子，插入的FasL cDNA經(jīng)DAN測(cè)序證實(shí)與Genebank中FasL序列相同，用PstI酶酶切重組質(zhì)粒，使之線性化，經(jīng)SP6核糖核酸聚合酶體外轉(zhuǎn)錄制備標(biāo)記的FasL cRNA探針(Dig-FasL cRNA)。收集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的肺癌新鮮標(biāo)本(經(jīng)病理證實(shí)，其中鱗狀細(xì)胞癌3例，腺癌2例，小細(xì)胞癌1例)，置于無菌Ep管中，經(jīng)液氮速凍運(yùn)輸，轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱中備用，標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛和15％蔗糖處理后制備成冰凍切片，厚度為6μm，再經(jīng)多聚甲醛后固定，非離子型去污劑處理細(xì)胞膜，在切片上用cRNA探針進(jìn)行原位雜交，經(jīng)四唑氮藍(lán)(NBT／BCIP)顯色，鏡下觀察FasLmRNA在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)分布情況。結(jié)果：DNA測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒中插入的FasL cDNA序列準(zhǔn)確無誤；標(biāo)記的FasL cRNA探針經(jīng)標(biāo)記效率檢測(cè)，標(biāo)記效率滿意；鏡下觀察發(fā)現(xiàn)三種病理類型的肺癌細(xì)胞胞漿中均可檢測(cè)到藍(lán)紫色雜交信號(hào)，表明肺癌細(xì)胞中存在FasL mRNA的表達(dá)。結(jié)論:FasL基因的克隆化成為肺癌細(xì)胞凋亡研究的工具;標(biāo)記的FasL mRNA探針為進(jìn)一步研究FasL mRNA在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)分布提供了有效手段:FasL作為促細(xì)胞凋亡基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系。

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