在對抗SARS-CoV-2感染時，治療性單克隆抗體（mAbs）會隨著刺突堿基的不斷替換，結(jié)合能力降低，從而變得不再有效。為了能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對保守受體結(jié)合域（RBD）的抗體，用于保護免受SARS-CoV-2相關(guān)變種和sarbecovirus的侵害，加州理工大學(xué)的研究者開發(fā)了Mosaic-8b RBD-納米顆粒疫苗，在60-mer納米顆粒上隨機展示八種sarbecovirus的RBD。在剛剛發(fā)布的數(shù)據(jù)中，研究者使用Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)的多重抗原特異性測定來分析由Mosaic-8b納米顆粒在兔子中誘導(dǎo)的IgGs的抗原反應(yīng)性，評估其交叉反應(yīng)性，并篩選出具有廣譜交叉結(jié)合能力的抗體。

研究結(jié)果

1、Mosaic-8b RBD納米顆粒疫苗

誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉反應(yīng)性抗體

研究者利用Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)的多重&多輪抗體檢測能力，評估Mosaic-8b RBD-NPs在兔子中誘導(dǎo)的單克隆抗體的廣泛結(jié)合能力。兔子在經(jīng)歷Mosaic-8b或SARS-2 RBD-納米顆粒進行初免和加強免疫后，分離PBMCs。富集IgG+記憶B細(xì)胞，并培養(yǎng)激活I(lǐng)gG分泌。使用Beacon®單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)篩選約27,000個激活的記憶B細(xì)胞。在Beacon®上開展連續(xù)四輪檢測，每輪使用四種熒光團多重測定，最終評估IgG分泌和對12種抗原的結(jié)合（圖1b），從而能夠分析B細(xì)胞的廣度（圖1c）。通過Beacon®集成軟件和手動驗證，用NanoPen上方的通道中熒光“bloom”來評估每種抗原的結(jié)合（圖1d）。

多重檢測實驗的結(jié)果顯示，與SARS-2免疫相比，使用Mosaic-8b進行免疫可使識別一系列匹配和不匹配受體結(jié)合域（RBDs）的B細(xì)胞百分比更高，而SARS-2免疫則使識別對應(yīng)的SARS-2 Beta RBD的B細(xì)胞百分比更高（圖1e）。此外，與SARS-2免疫相比，Mosaic-8b免疫可使識別多種RBDs（即具有廣泛交叉反應(yīng)性的單克隆抗體）的B細(xì)胞百分比更高（圖1f）。從Mosaic-8b RBD-NP免疫兔子樣本中導(dǎo)出90個分泌IgGs的B細(xì)胞，這些IgGs能夠結(jié)合12種測定抗原中的任何一種，首先導(dǎo)出分泌結(jié)合>6種抗原的IgGs的細(xì)胞，然后是分泌結(jié)合較少抗原的IgGs的細(xì)胞。最終對分離的14個RBD結(jié)合mAbs的配對重鏈和輕鏈基因進行重組表達。

圖1. 表征兔子記憶B細(xì)胞分泌具有廣泛交叉反應(yīng)IgG的特征。(a) 多重檢測評估IgG結(jié)合廣度。單個B細(xì)胞在NanoPen中分泌的抗體被抗兔IgG珠子捕獲，并用與FITC偶聯(lián)的抗兔IgG二抗或用不同熒光素標(biāo)記的抗原檢測。(b) 四輪單B細(xì)胞篩選檢測，每個檢測都評估IgG分泌（FITC）和對三種不同抗原（分別標(biāo)記為TR、Cy5或PE）的結(jié)合。(c) 一個多重結(jié)合檢測的視野圖像。(d) 根據(jù)在中NanoPen®上方通道中的“blooming”來判斷對應(yīng)單克隆抗體的抗原結(jié)合情況。被判定為對廣泛抗原結(jié)合呈陽性的單B細(xì)胞被導(dǎo)出。(e)在單細(xì)胞多重檢測中比較用mosaic-8b RBD-NP或SARS-2 RBD-NP免疫的兔子的B細(xì)胞，每個RBD結(jié)合的含有單個B細(xì)胞的IgG+ NanoPen的百分比，以及(f) IgG+ NanoPen中分泌的IgG識別1到11個RBD的百分比。

2、兔mAbs具有廣泛交叉反應(yīng)特性

本研究通過ELISA檢測了由Mosaic-8b RBD-納米顆粒誘導(dǎo)的兔單克隆抗體對多種sarbecovirus RBDs的識別能力，發(fā)現(xiàn)部分單克隆抗體具有廣泛的結(jié)合能力（圖2）。進一步通過競爭ELISA鑒定出這些單克隆抗體在SARS-2 RBD上的表位，其結(jié)果與之前研究一致。此外，使用假病毒中和實驗評估了這些單克隆抗體的中和效力和廣譜性，發(fā)現(xiàn)M8b-A10和M8b-C9在測試的病毒系列中表現(xiàn)出較好的效力和廣譜性，而Pemgarda對Class 2的sarbecovirus的結(jié)合能力較弱，提示其可能對Class 2的sarbecovirus的溢出事件無效。

圖2.從接種Mosaic-8b的兔子中分離出的單克隆抗體對SARS-2和其他sarbecovirus具有廣泛的識別能力。(a) 通過ELISA檢測從接種鑲嵌-8b RBD-納米顆粒的兔子中分離出的單克隆抗體對RBD結(jié)合的廣譜性。(b) 競爭ELISA用于鑒定單克隆抗體的表位。(c) 兔單克隆抗體對包括SARS-2 D614G、五種SARS-2 VOCs、三種非SARS-2 sarbecovirus和兩種嵌合刺突假病毒在內(nèi)的12種假病毒的中和作用。

3、DMS揭示了多個RBD表位

通過深度突變掃描（DMS）技術(shù)，研究者們對五種兔單克隆抗體（M8b-A10、M8b-B1、M8b-B8、M8b-C9和M8b-C10）所靶向的RBD表位中的關(guān)鍵氨基酸殘基進行了詳細(xì)分析。結(jié)果顯示，這些單克隆抗體的表位逃逸特征與其在ELISA和中和實驗中的表現(xiàn)以及競爭ELISA的表位分類高度一致。例如，M8b-A10和M8b-C9對特定殘基（如378、411、413和427）的替換較為敏感，而M8b-B1則對可能引入N-糖苷的殘基替換較為敏感。這些發(fā)現(xiàn)有助于深入了解這些單克隆抗體的結(jié)合特性和中和機制。

4、3D結(jié)構(gòu)解釋單克隆抗體的特性

研究者通過解析兔單克隆抗體Fab片段與SARS-2刺突蛋白復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)，深入分析這些抗體的識別和中和機制。研究發(fā)現(xiàn)，這些單克隆抗體通過不同的RBD構(gòu)象識別模式與其結(jié)合，且其結(jié)合足跡和表位特征與之前的競爭ELISA和DMS結(jié)果一致。這些結(jié)構(gòu)分析不僅揭示了兔單克隆抗體的結(jié)合特性，還為設(shè)計更有效的疫苗和治療策略提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

5、跨物種Class 1/4單克隆抗體特征

研究繼續(xù)探討了不同物種（如兔、小鼠和人類）中誘導(dǎo)的抗RBD單克隆抗體的識別特征是否保守。分析發(fā)現(xiàn)，源自不同物種的單克隆抗體可能具有相似的識別基序，這些基序可能來自不同的抗體基因片段或V-D-J重組過程中的N區(qū)添加。例如，人類單克隆抗體中存在一類具有CDRH3 YYDxxG基序的抗體，它們通過特定的氫鍵模式識別RBD的Class 1/4表位。類似的識別模式也在兔單克隆抗體M8b-C9中被發(fā)現(xiàn)，盡管其YY基序源自N區(qū)添加而非D基因片段。這些發(fā)現(xiàn)表明，免疫系統(tǒng)在不同物種中可能獨立地發(fā)展出相似的識別策略來對抗SARS-2病毒。

6、體外選擇實驗揭示病毒功能逃逸

通過細(xì)胞培養(yǎng)選擇實驗研究兔單克隆抗體對病毒逃逸的敏感性。實驗使用編碼不同SARS-2和SARS-1刺突蛋白的rVSV，在不同兔單克隆抗體的存在下進行選擇，以觀察病毒逃逸變體的出現(xiàn)。結(jié)果顯示，不同單克隆抗體導(dǎo)致病毒在RBD表位內(nèi)或外的不同殘基發(fā)生替換，這些替換與之前的結(jié)構(gòu)分析和DMS結(jié)果一致。例如，M8b-A10導(dǎo)致SARS-2和SARS-1病毒在4類RBD表位內(nèi)的殘基發(fā)生替換，而M8b-B1致使病毒在表位內(nèi)外的殘基發(fā)生替換。這些實驗揭示了病毒逃逸的潛在路徑，并為理解單克隆抗體的中和機制和病毒適應(yīng)性提供了重要信息。

總結(jié)

研究者使用Mosaic-8納米顆粒對兔子進行免疫，并通過Beacon®的多重結(jié)合檢測法預(yù)篩選具有廣泛識別能力的抗體。在僅篩選了14種單克隆抗體的情況下，研究者就發(fā)現(xiàn)了與Pemgarda表位重疊或相似的M8b-B8和M8b-C10，以及具有廣泛交叉反應(yīng)性的Class 4（M8b-A10）和Class 1/4（M8b-C9）單克隆抗體。這表明，盡管人類和動物之間的抗體基因片段庫存在差異，但免疫系統(tǒng)可以利用不同的抗體基因片段來實現(xiàn)相似的抗原識別模式。Beacon®多重檢測方法的重要性在于其能夠快速評估單克隆抗體對多種抗原的結(jié)合能力，從而高效篩選出具有廣泛識別能力的抗體，這對于開發(fā)針對SARS-2及其變體的廣譜中和抗體具有重要意義。