實驗材料： 
1、所有用于細胞培養(yǎng)的器械、器皿劑溶液必須滅菌消毒。 
2、多聚賴氨酸鋪板  以磷酸鹽緩沖液(PBS)或蒸餾水榮分解多聚賴氨酸（分子量為30-70KD）至1mg/ml。分裝儲存。臨用前稀釋至終濃度為20-60mg/ml過濾備用。在培養(yǎng)板或皿中加少量多聚賴氨酸溶液，以覆蓋底部為宜，在37℃、CO2孵箱中置夜。次日，用移液管吸取多聚賴氨酸，并用水洗2-3遍，晾干備用，如果培養(yǎng)目的適用于電生理的單細胞記錄或者免疫組化和熒光染色，則在培養(yǎng)皿的底部加上蓋玻片，多聚賴氨酸鋪于蓋玻片上，則更易得到強烈的熒光信號。 
3解剖液（HEPES平衡鹽溶液）  取 100ml 10x 平衡鹽溶液（Hank’s balance salt solution,HBSS） HEPES         3.9g, NaHCO3           0.84g， 青霉素         104 U, 鏈霉素         100mg， H2O            800ml。 
以1mol/LHCl調(diào)節(jié)PH至7.2，再加H2O之后總體積為1L，以0.2μm直徑的濾菌器過濾，4℃保存。 
4、DMEM 培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）DMEM 培養(yǎng)基500ml，加小牛血清和或馬血清各10%（血清需經(jīng)56℃，30min 滅活）1% 的青/鏈霉素. 
5、無血清培養(yǎng)基  zui常用的一種無血清培養(yǎng)基為，Neurobasal+2%的b27+1%抗生素 6、2.5%胰蛋白酶（typsin）  溶液 臨用前以解剖液稀釋至終濃度0.125%。 7、臺盼藍(typan blue )溶液 終濃度為0.2%-0.4%。 8、阿糖胞苷 終濃度為8-10 μmol/L。 
9、動物妊娠天數(shù)的選擇 通常選擇出生24h之內(nèi)的乳鼠。 實驗步驟： 
1、脫臼處死乳鼠，75%的酒精浸泡3-5min，將清洗完的乳鼠放入含預冷解剖液的培養(yǎng)皿中。 
2、用兩把尖鑷逐個去除鼠的頭部皮膚和顱骨，取出全腦，置于另一含預冷解剖液的（PBS？）培養(yǎng)皿中，小心剝離并去除腦膜及脈絡叢。 
3、在中線處用尖鑷分離大腦半球，在解剖顯微鏡下小心去除嗅球、中隔、丘腦及下丘腦，剝離腦膜及脈絡叢，在大腦皮層下方小心取出海馬，置于含冰冷解剖液的6cm培養(yǎng)皿中。 

4、用彎頭尖鑷把海馬剪成小碎片，收集全部海馬碎片，置于一含有0.25%胰蛋白酶溶液的培養(yǎng)皿中（該溶液必須在37℃孵箱中預暖），在孵箱中消化5-7min。 
5、收集全部海馬碎片，置于10ml預暖的DMEM培養(yǎng)基的試管中（培養(yǎng)基中含有10%的胎牛血清和或馬血清各，1%抗生素，以及谷氨酰胺）。用培養(yǎng)基洗2-3遍，以中止消化反應。 
6、加少量培養(yǎng)基于試管中，以中空塑料管反復吹打10-15次，直成細胞懸液。加培養(yǎng)基于同一試管中至約10ml，靜置約10min。取1-2μl細胞懸液于99μl0.2%-0.4%臺盼藍溶液中，用細胞計數(shù)板計算存活和死亡的細胞數(shù)，從而測定細胞密度(細胞計數(shù)：活體細胞具有排斥臺盼藍的能力，而死亡細胞則能吸收臺盼藍變成藍色)。 
7、根據(jù)實驗需要，以培養(yǎng)基稀釋細胞懸液至所需的細胞密度，接種細胞至經(jīng)多聚賴氨酸鋪板置夜處理的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。通常細胞密度為（2-2.5）x105細胞/cm2. 8、待6-8h細胞貼壁后，換培養(yǎng)基為含2%B27的Neurobasal，含有B27 和0.5mM的谷氨酰胺。 
9、培養(yǎng)2-3d培養(yǎng)基中加入8-10μmol的阿糖胞苷，以抑制或阻止非神經(jīng)細胞和原代膠質增殖。 
10、每三天用Neuronbasal使用液半量換液 三、形態(tài)學觀察 
細胞接種6-12h，開始貼壁，細胞成圓形或橢圓形，兩周后神經(jīng)元zui為豐滿，胞體圓形或多角形，四周暈光明顯，胞核及核仁清晰可見，位于細胞*或一邊，神經(jīng)多而粗大，分支成網(wǎng)絡。培養(yǎng)一月后，細胞開始退化。一般認為，培養(yǎng)2-4周開始實驗比較適宜。 附： 
血細胞計數(shù)法及臺盼藍測細胞活度

（一） 
實驗材料和實驗前準備 
1、  顯微鏡， 血細胞計數(shù)器， 蓋玻片 
2、 毛細移液管，1 ml血清移液管，5ml試管，擦鏡紙或軟布

3、  0.4%的臺盼藍溶液，0.3%苯胺黑（nigrosin）溶液，95%， 乙醇 
4、  用擦鏡紙或者軟布將血細胞計數(shù)板的計數(shù)池擦干凈。再用酒精95%血細胞技術板和蓋玻片，晾干備用。 

5、 講清潔干凈的蓋玻片覆蓋于血細胞技術板的計數(shù)池上。

6、  胞濃度=4大格細胞數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104/m

（二）實驗步驟 
1、制備制備細胞懸液  取一試管，分別加入0.4%臺盼藍溶液 0.2ml (或0.3%苯胺黑溶液)及混合均勻的細胞懸液0.8 ml，用手輕柔振蕩試管，以混合懸液和染料。 
2、以中空移液管輕柔混勻細胞懸液后，立即用毛細移液管吸取少量細胞懸液，置移液管尖頭于細胞計數(shù)板計數(shù)池的邊緣（小心不要移動蓋玻片），緩緩釋放細胞懸液。通常一側計數(shù)池可以容納20 ul細胞懸液。 3、細胞計數(shù)  每個正方形的邊側都有三根線，在左側和上方，應將接觸到三根線的中線的內(nèi)側線的細胞計算在內(nèi)，技術兩側計數(shù)池，共八個正方形。 四、注意事項 
1、 L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml） 包被培養(yǎng)板后，要待其干后才能接種，因為其對神經(jīng)元有毒性。L-多聚賴氨酸（0.1mg/ml）能回收再利用。 2 、取腦組織時動作盡量要快，并且盡量低溫操作。 
3 、分離皮層和海馬時，要盡量分離腦膜和血管，否則有大量的成纖維細胞。 4 、用吸管輕輕吹打細胞時，盡量不起泡沫，以免損傷神經(jīng)元。 5 、接種細胞的過程，動作要快，以免細胞聚集。 6 、接種細胞后，24h勿移動，以免影響細胞貼壁。 五、結果、 
大多數(shù)神經(jīng)元在接種1h內(nèi)貼壁，3-5h開始變平，并長出1-2個突起。3天后，許多細胞從胞體長出數(shù)個突起。神經(jīng)元在7-10天開始成熟，胞體逐漸長至30-40um,暈光明顯，胞核和核仁清晰可見，突起變粗，變長并且有分支，邊緣清楚，發(fā)亮，形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡。神經(jīng)元可存活1-2月。