ProAqa親和色譜柱是設計用于HPLC和FPLC系統(tǒng)的高流速高壓色譜柱。其固定相采用平均粒徑為20 µm的多孔聚乙烯二乙烯基苯（PS/DVB）為基質，表面鍵合一層親水涂層，涂層上以化學鍵合的方式連接了蛋白質A，蛋白質A可結合除IgG3之外的含F(xiàn)c片段的免疫球蛋白。該色譜柱可用于抗體和融合蛋白（可特異性結合重組蛋白A）的定量和小規(guī)模純化。

Figure 1.抗體樣品在ProAqa 2.1×30 mm柱上的穿透曲線(Mab 321 from Sepax Technologies, Inc.) 。流動相：磷酸鈉緩沖溶液，0.1M, pH 7.4, NaCl, 0.15M, 0.15mg/mL Mab 321；流速：2.0 mL/min；檢測波長：280nm

技術參數(shù)

空白運行

    必須使用高純度的緩沖鹽，并在使用前過濾(0.22 or 0.45 μm)所有的緩沖溶液。

    上樣前，必須執(zhí)行空白運行，并監(jiān)測本底。為了減小結合和洗脫緩沖溶液之間變化產生的基線變化，建議使用：     
(a) 50 mM磷酸鹽 pH 7, 0.15 M NaCl 作為起始/淋洗緩沖溶液，以及 
(b) 0.1% (12 mM) HCl 0.15 M NaCl 作為洗脫緩沖液。

    以上是zui有效的淋洗/洗脫系統(tǒng)，產生的基線波動zui小。如果要求洗脫樣品保留生物活性，不建議使用鹽酸(HCl)，因為鹽酸會使抗體變性。

樣品的準備和上樣

    為了確保樣品的有效結合和避免色譜柱篩板被污染，一般按照以下方式來準備樣品：
(a) 將樣品溶解到或溶劑替換為起始/淋洗緩沖液，這對于大體積樣品尤為重要(超過25%的柱體積)。
(b) 進樣前離心或過濾樣品 (0.22 或0.45 μm)。
(c) 對血清樣品進行熱處理（置于56 °C 下30分鐘）以去除會堵塞色譜柱的纖維蛋白原。
(d) 對樣品進行去脂處理，因為脂類會對色譜柱產生不可逆的污染。
(e) 所有樣品使用前應該用0.45 μm或0.2 μm濾膜過濾。

    為了確保樣品的有效結合和避免填料與色譜柱被污染，需要對樣品載量進行測定： 
(a) ProAqa 動態(tài)結合載量見“描述”。
(b) 其它抗體的結合載量取決于抗體來源與所屬子類以及所使用的配體。但是一般會低于“描述”中IgG的載量。
(c) 當作為分析用途時，可通過標準線性曲線測定zui小和zui大上樣量。

起始/淋洗緩沖液

(a) 絕大多數(shù)情況下，使用簡單的緩沖鹽如10 ~ 50 mM 磷酸鹽或Tris。
(b) 起始/淋洗緩沖液的pH范圍可在6.0到9.0之間，但需注意當pHzui高的時候結合力zui強。
(c) 加入一些鹽 (0.1到0.2 M 的NaCl或KCl) 以防止因蛋白/蛋白相互作用引起的非特異性吸附。

洗脫條件

    如果色譜柱作為分析用途，洗脫緩沖液為含25-100 mM 磷酸鹽，pH為 2.0-3.5，含0-150 mM氯化鈉的溶液。其它可能會用到的洗脫緩沖鹽組分包括鹽酸、甘氨酸、檸檬酸、乙酸或其它可調低pH的組分。

    如果色譜柱作為制備用途，可采用以下條件。 
(a) 對于絕大多數(shù)抗體的洗脫，可將pH降至2-3，常用緩沖體系包括磷酸鹽、乙酸鹽、鹽酸和甘氨酸。根據緩沖體系的不同，緩沖鹽濃度為6-100 mM或2-20% (v/v)。
(b) 可用含0.15 M NaCl的6-12 mM HCl來獲得理想的pH范圍，并將基線波動降到zui低程度。 
(c) 由于抗體會因其種類和所屬子類的不同而表現(xiàn)出不同的結合/洗脫行為，*的洗脫條件需要通過經驗性地測定。

例1 單克隆抗體在ProAqa色譜柱上的洗脫