小鼠腫瘤浸潤(rùn)組織白細(xì)胞分離液試劑盒（細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)）說(shuō)

明書(shū)

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

 名稱 產(chǎn)品編號(hào) 規(guī)格

A 各種動(dòng)物組織白細(xì)胞分離液 詳見(jiàn)附錄 1 100ml

B F 液（贈(zèng)品） F2013TBD 100ml

C 紅細(xì)胞裂解液（贈(zèng)品） NH4CL2009 100ml

D 全血及組織稀釋液（贈(zèng)品） 2010C1119 100ml

E 細(xì)胞洗滌液（贈(zèng)品） 2010X1118 100ml

注：本試劑內(nèi)容中各單品可根據(jù)貨號(hào)單獨(dú)購(gòu)買，客戶可根據(jù)實(shí)際使用情況自行選擇購(gòu)買。

【預(yù)期用途】

適用于從動(dòng)物組織中分離白細(xì)胞，無(wú)菌條件下所分離的白細(xì)胞可用于分子生

物學(xué)及細(xì)胞培養(yǎng)等。本品僅供科研使用。

【檢驗(yàn)原理】

本分離液為 FICOLL、羥乙一基淀粉 550 與泛影酸葡甲胺的混合液?？鼓?/span>

可在分離液中分層。離心時(shí)，在 FICOLL、羥乙一基淀粉的作用下紅細(xì)胞與粒細(xì)胞

聚集并迅速沉降；此時(shí)，白細(xì)胞仍處于分離液上層及分離液層，紅細(xì)胞污染可通

過(guò)紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞去除。大部分血小板可在細(xì)胞清洗低速離心過(guò)程中去

除。

其他人及動(dòng)物多種比重細(xì)胞分離液，因不同種屬不同比重分離液的細(xì)胞離散

系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶在制定分離液時(shí)應(yīng)提供所需分離液的比重、動(dòng)物種屬

及被分離細(xì)胞的名稱。

【*但不提供的儀器及耗材】

可提供 400g 離心力的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)、15ml 玻璃離心管、吸管及標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清

（產(chǎn)品編號(hào)：TBD31HB）等。

【注意事項(xiàng)】

1. 使用前，本分離液需復(fù)溫至 18-22℃。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在獲得

樣本 2 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，存放時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞活性越低。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如需勻漿組織或洗滌細(xì)胞，不可使用含 Ca、Mg 離子的緩沖液及

培養(yǎng)液，其成分會(huì)大大降低細(xì)胞得率及純度。本公司生產(chǎn)的全血及組織稀釋液和

細(xì)胞洗滌液不含 Ca、Mg 離子、低內(nèi)毒素水平且含細(xì)胞和保護(hù)成分，推薦使用。

3. *抗凝劑選擇：EDTA、枸櫞酸、肝素，其他抗凝劑也可使用，但會(huì)影響細(xì)

胞活性。

4. 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，不可使用含粉手套、不可使用內(nèi)毒素含量過(guò)高的液體，手套中

的粉末顆粒及高內(nèi)毒素會(huì)激活細(xì)胞從而降低細(xì)胞得率及活性。建議使用天津?yàn)?/span>

配套相關(guān)產(chǎn)品。

5. 本實(shí)驗(yàn)不可使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，其帶有的靜電作用

將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁影響分離效果。

6. 吸取過(guò)多的白細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使

混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

7. 吸取過(guò)多的白細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

8. 如需進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，則需樣本貯藏時(shí)間不得多于 10 小時(shí)，否則將導(dǎo)致細(xì)胞被

激活，得率降低。

9. 為去除所混雜的血小板，可在分離液上層加上 4-20%蔗糖梯度等滲溶液進(jìn)行

二次離心。

10. 細(xì)胞純度可在步驟 10 后使用瑞氏染色方法確定，細(xì)胞活性可用臺(tái)盼藍(lán)處理

后觀察。

11. 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭?/span>

體詳見(jiàn)“【生產(chǎn)企業(yè)】”項(xiàng)目下內(nèi)容。

【組織單細(xì)胞懸液的制備方法】

注： A. 組織勻漿液需先用現(xiàn)配，配制方法為：40ml 胎牛血清與 60mlF 液混勻，備用（現(xiàn)

用現(xiàn)配）。

B．本試劑盒中不包含膠原酶，若采用酶消化法制備單細(xì)胞懸液，請(qǐng)用戶根據(jù)各實(shí)驗(yàn)

室要求另購(gòu)不同類型膠原酶。

Ⅰ. 剪碎法：將組織塊放入平皿后，加入少量組織勻漿液；用眼科剪將組織剪至

勻漿狀，加入 5ml 組織勻漿液；用吸管吸取組織勻漿，用 100 目不銹鋼濾網(wǎng)(另

購(gòu))過(guò)濾到試管內(nèi)；離心沉淀 1500 轉(zhuǎn)/分×3 min，再用細(xì)胞洗滌液清洗 3 次，每

次以 500rpm 短時(shí)低速離心除去細(xì)胞碎片，以 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾去

細(xì)胞團(tuán)塊。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。常溫下放置, 待

測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108

-1×109個(gè)/ml

的單細(xì)胞懸液備用。

Ⅱ. 勻漿器法：用眼科剪將組織剪成小塊；放入 70ml 組織研磨器內(nèi)，加入 2ml

組織勻漿液；緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)研棒，研磨至勻漿；用 5ml 組織勻漿液沖洗研器；收集細(xì)

胞懸液，經(jīng) 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾；離心沉淀 800rpm×2min ，再用細(xì)

胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107個(gè)/ml。MANUFACTURE CO.,LTD - 3 -

www.tbdscience.com◆:gx

灝洋生物 TBDsciences

常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用全血及組織稀釋液懸起細(xì)胞濃度為 2×108

-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

Ⅲ. 酶消化法：

A． 用 F 液將膠原酶稀釋，終濃度為 400 U/ml，至于冰浴備用。

B． 取一適當(dāng)大小培養(yǎng)皿進(jìn)行操作：用鑷子夾碎動(dòng)物脾臟，加入稀釋后的膠原酶，

37℃消化 20 分鐘。

C． 以 100 或 200 目不銹鋼濾網(wǎng)（另購(gòu)）過(guò)濾，離心沉淀 800prm×2min ，再用

細(xì)胞洗滌液洗 3 次，離心沉淀。作細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～5）×107

個(gè)/ml。常溫下放置, 待測(cè)細(xì)胞的活力。分離前用全血及組織稀釋液懸起細(xì)

胞濃度為 2×108

-1×109個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液備用。

細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:

細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用來(lái)計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中細(xì)胞數(shù)量的一種方法。一般利用計(jì)數(shù)板

（血球計(jì)數(shù)板）進(jìn)行。既可用于分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)接種前計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸

液中的細(xì)胞數(shù)量，也可用于對(duì)培養(yǎng)物的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。不論計(jì)數(shù)的對(duì)象如何，

均須制備分散的細(xì)胞懸液。

計(jì)數(shù)與計(jì)算過(guò)程

1）、在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)的蓋玻片。

2）、用玻璃虹吸管吸取細(xì)胞，讓虹吸管在蓋玻片上或下側(cè)的計(jì)數(shù)板凹蹧處流

出懸液，至蓋玻片被液體充滿為止。

3）、置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。對(duì)于壓線的細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上

線和左線者，對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4）、按下式計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液的密度：

細(xì)胞密度＝（4 個(gè)大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104個(gè)/ml×稀釋倍數(shù)

公式中乘以 104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：

1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3

細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：

A． 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于 104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很

少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；顯微鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇到 2 個(gè)以上細(xì)胞組成

的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞團(tuán)>10％，說(shuō)明細(xì)胞分散不充分; 或細(xì)

胞數(shù)<200 個(gè)/10mm2或>500 個(gè)/10 mm

2 時(shí)，說(shuō)明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。

B． 要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。

C． 取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其是多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次

取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

D． 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)

算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)左線，不計(jì)右線。

E． 操作時(shí)，注意蓋玻片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑?，否則要

重新計(jì)數(shù)。

初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：

A． 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。

B． 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。

C． 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。

【檢驗(yàn)方法】

1. 取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液置于 18-22℃。

2. 取 3ml 細(xì)胞懸液小心加于分離液之液面上。18-22℃，400g 離心 20 分鐘。低

溫（如 4 度）離心會(huì)降低細(xì)胞得率。

3. 離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含白細(xì)胞的細(xì)胞層）0.5cm 以上的

上清液部分，棄去。

4.用吸管小心吸取分離液層、白細(xì)胞層及紅細(xì)胞層置于另一新離心管內(nèi)。

5. 在步驟 4 中所得離心管中加入 10ml 細(xì)胞洗滌液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）混

勻。

6. 250g 離心 10 分鐘。

7. 棄上清，沉淀使用紅細(xì)胞裂解液（Cat#：NH4CL2009）裂解紅細(xì)胞（裂解過(guò)程

參見(jiàn)下述【紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明】）。

8. 裂解后再經(jīng)三次洗滌去除紅細(xì)胞內(nèi)溶物和碎片后即為所需白細(xì)胞。

9.后以 0.5ml 后續(xù)試驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

WBC Separation Medium

【紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明】

本裂解液有別于市場(chǎng)上銷售的其它紅細(xì)胞裂解液，其配方經(jīng)過(guò)本公司優(yōu)化在裂解紅細(xì)

White Blood

Cell

20 Minutes

Cell Suspension Diluentwww.tbdscience.com

本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測(cè)

胞的同時(shí)不損傷并在一定程度上保護(hù)淋巴細(xì)胞(lymphocyte)或其它有細(xì)胞核的細(xì)胞，所獲

得的細(xì)胞可保持完好的生物活性和完整的細(xì)胞形態(tài)。另外，本裂解液中無(wú)DNA及RNA酶，配

合細(xì)胞分離液使用所提細(xì)胞可廣泛用于細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)廣大用戶從優(yōu)選擇。

紅細(xì)胞裂解液(Red Blood Cell Lysis Buffer)，也稱ACK Lysis Buffer，是一種用于

從人或鼠等的血液或組織細(xì)胞樣品中裂解并去除無(wú)細(xì)胞核紅細(xì)胞的溶液。

本裂解液不適用于有細(xì)胞核紅細(xì)胞的裂解，例如鳥(niǎo)或禽類的紅細(xì)胞。本裂解液經(jīng)過(guò)無(wú)菌

處理，處理過(guò)的血液或組織細(xì)胞樣品可以用于后續(xù)的原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合以及核酸或蛋白的

提取及各種常規(guī)的分析和檢測(cè)。

使用說(shuō)明：

A. 對(duì)于組織細(xì)胞樣品：

a. 新鮮組織經(jīng)過(guò)膠原酶或胰酶等消化處理，通過(guò)適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。

b. 加入3-5倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體

積為1ml，則加入3-5ml的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不

會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清。可再重復(fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細(xì)胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

B. 對(duì)于組織細(xì)胞樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟：

a. 新鮮組織經(jīng)過(guò)膠原酶或胰酶等消化處理，通過(guò)適當(dāng)方法分散成細(xì)胞懸液，離心棄上清。

b. 對(duì)于0.2ml細(xì)胞沉淀加入1ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。本步驟在室溫

或4度操作均可。

c. 加入15-20ml PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，混勻。

d. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

e. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不

會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過(guò)程中的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，

時(shí)不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí)需要大體積的離心管。

C. 對(duì)于血液樣品：

a. 取新鮮抗凝血，400-500g離心5分鐘，離心棄上清。

b. 加入6-10倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1-2分鐘。例如細(xì)胞沉淀的體

積為1ml，則加入6-10ml的紅細(xì)胞裂解液。本步驟在室溫或4度操作均可。注意：對(duì)于鼠

的血液，裂解1-2分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜延長(zhǎng)裂解時(shí)間至4-5分鐘，并且裂

解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不

會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。

e. 洗滌1-2次：加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，重懸沉淀，400-500g離心

2-3分鐘，棄上清?？稍僦貜?fù)1次，共洗滌1-2次。洗滌液的用量通常應(yīng)至少為細(xì)胞沉淀

體積的5倍。4℃離心效果更佳。

f. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：對(duì)于微量或少量的血液樣品，可以在*步中不進(jìn)行離心棄上清的操作，直接在第二步中加入10倍血

液體積的紅細(xì)胞裂解液，并在室溫或4℃裂解4-5分鐘。對(duì)于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外

周血，宜延長(zhǎng)裂解時(shí)間至10分鐘，但通常不宜超過(guò)15分鐘，并且裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞

裂解。后續(xù)步驟相同。

D. 對(duì)于血液樣品無(wú)需洗滌的快速操作步驟：

a. 每1ml新鮮抗凝血中加入10ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解4-5分鐘。本步驟在室

溫或4度操作均可。注意：對(duì)于鼠的血液，裂解4-5分鐘已經(jīng)足夠，對(duì)于人的外周血，宜

延長(zhǎng)裂解時(shí)間至10分鐘，但通常不宜超過(guò)15分鐘，并且裂解過(guò)程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促

進(jìn)紅細(xì)胞裂解。

b. 加入20-30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液，混勻。

c. 400-500g離心5分鐘，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

d. 如果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。通常極微量的紅細(xì)胞不

會(huì)影響后續(xù)的一些檢測(cè)。

e. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用適當(dāng)溶液重懸細(xì)胞沉淀后即可進(jìn)行計(jì)數(shù)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：對(duì)于常規(guī)步驟，多一步洗滌過(guò)程的離心，但可以節(jié)省洗滌液的用量，并且洗滌效果也更好一些，同時(shí)

不需要大體積的離心管?？焖俨襟E少了一次離心，但洗滌效果略差一些，同時(shí)需要大體積的離心管。

【儲(chǔ)存條件及有效期】 www.tbdscience.com

18-25℃避光保存，有效期 2 年。啟封后置 4℃保存，溶液變渾濁或感染細(xì)

菌時(shí)，產(chǎn)品失效。本品為真空包裝，未啟封前置于 10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，

影響分離效果。

【適用儀器】

半徑 15cm 水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)。

【樣本要求】

本分離液要求樣本為新鮮的細(xì)胞懸液，樣本收集時(shí)應(yīng)無(wú)菌操作且在儲(chǔ)存、處

理和運(yùn)輸過(guò)程中避免冷凍和冷藏。

【參考值（參考范圍）】

本實(shí)驗(yàn)白細(xì)胞的提取率及純度均大于 80%。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

由于各品牌離心機(jī)的性能不同，國(guó)內(nèi)南北地區(qū)溫度環(huán)境和四季的差異，可能

影響分離效果，用戶可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心的時(shí)間，摸索*的分離條件（具

體分離條件各實(shí)驗(yàn)室自定）。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

本試驗(yàn)要求，在正常大氣壓下，樣本、分離液及分離環(huán)境溫度為 18-22℃。

本分離液在低溫時(shí)呈較高密度，在高溫時(shí)呈較低密度。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

pH 7.0-7.5

滲透壓 280-340mOsmol/kg

無(wú)菌 直接接種培養(yǎng) 14 天后培養(yǎng)基澄清

澄明度及不溶性顆粒物 每 50ml 溶液中含 10μ m 以上的不溶性微粒 20 粒以

下，含 25μ m 以上的不溶性微粒 5 粒以下

【參考文獻(xiàn)】

1 鄭德先，吳克復(fù)，褚建新.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究方法與技術(shù).北京醫(yī)科大學(xué)

協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1999

2 鄂征.組織培養(yǎng).北京出版社，1995

3 朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.人民軍醫(yī)出版社，2000