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| 產(chǎn)品說明： |
Mynox是目前*可殺滅支原體的生物制劑 有效去除細(xì)胞培養(yǎng)及病毒保存中支原體的污染 規(guī)格：2次，5次，10次 特點(diǎn)：
支原體去除試劑Mynox使用常見問題 Mynox說明書 相關(guān)文獻(xiàn)：Mynox文獻(xiàn) |
| 所屬公司：德國Minerva Biolabs公司產(chǎn)品 所屬類別：支原體檢測、去除、預(yù)防試劑 |
Mynox® 支原體去除試劑
1. 試劑及材料
1.1 試劑盒組分
操作手冊
Mynox試劑：無菌、即用型溶液（PBS緩沖液），PH 7.4，220 µl/管
Cat. No. 10-0200 2 管
Cat. No. 10-0500 5 管
Cat. No. 10-1000 10 管
1.2 穩(wěn)定性與保存
Mynox在有效期（見包裝盒標(biāo)簽）內(nèi)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。應(yīng)于2-8°C保存。
運(yùn)輸過程中，應(yīng)保持室溫。
1.3 其他所需的試劑及設(shè)備
標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備
培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液、胰酶
無菌培養(yǎng)皿
Venor®GeM支原體檢測試劑盒（Minerva Biolabs公司）
2. 應(yīng)用及原理
不論從生物學(xué)還是經(jīng)濟(jì)學(xué)角度考慮，去除細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體感染，對于基礎(chǔ)研究、診斷和生物技術(shù)的生產(chǎn)都是至關(guān)重要的。應(yīng)用抗生素處理是殺滅或抑制細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的zui常用方法。一般來說，抗生素治療不但不能有效持久地去除支原體，而且，抗生素還容易對細(xì)胞產(chǎn)生不良的細(xì)胞毒作用，并引起支原體菌株的耐藥性。
目前，Mynox是*種也是*可殺滅支原體的生物制劑。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Mynox僅使用一次即可*有效的消除支原體。
Mynox取自枯草桿菌發(fā)酵后的提取物。由于支原體沒有細(xì)胞壁，只有簡單的質(zhì)膜，因此，Mynox基于生物物理原理，只與支原體膜特異性結(jié)合，改變支原體膜的通透性，導(dǎo)致支原體破裂死亡，而細(xì)胞膜不與Mynox結(jié)合，從而，不會改變細(xì)胞的任何特性，故細(xì)胞毒性極低。支原體殺死后，細(xì)胞能夠很快恢復(fù)其正常的生長與繁殖狀態(tài)。
注意：Mynox僅限于基礎(chǔ)研究使用。
3. 樣品材料
3 .1 血清濃度的重要性
反應(yīng)混合物中脂肪和蛋白質(zhì)的濃度可影響Mynox消除支原體的活性，例如：胎牛血清的濃度。這些成分可阻止Mynox與支原體膜的結(jié)合。因此，消除細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體，應(yīng)使用特定的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基，例如：D-MEM或RPMI 1640培養(yǎng)基。如果使用Mynox消除污染細(xì)胞中的支原體，胎牛血清的*濃度為5%。如果使用Mynox消除病毒中的支原體，建議使用無血清的培養(yǎng)基。
3.2 Mynox的使用范圍
由于Mynox不與細(xì)胞膜結(jié)合，因此，它不能消除細(xì)胞內(nèi)的支原體污染。然而，支原體污染通常發(fā)生在細(xì)胞外，只有penetrans種屬的支原體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但是，迄今為止，尚未有關(guān)于penetrans種屬支原體引起污染的報(bào)道。另外，為了減小血清對消除支原體的影響，還需制定適用于消除高蛋白、高脂情況下的支原體污染的方案。
Mynox利用生物物理的方法，與支原體膜結(jié)合，因此，Mynox必須直接接觸支原體，才能有效殺除。我們建議使用胰酶消化細(xì)胞，使細(xì)胞充分脫落分離，與Mynox充分接觸，從而，更有效地殺除支原體。
3.3 Mynox是否對細(xì)胞有損傷
同其他消除支原體的產(chǎn)品相比，Mynox對于貼壁和非貼壁系細(xì)胞的影響不大。通過對眾多細(xì)胞系的測試，我們發(fā)現(xiàn)治療后的細(xì)胞，不但支原體被*殺除，而且，移種后的細(xì)胞仍然能夠保持正常的高增殖率。
4. 說明
4.1 貼壁細(xì)胞系支原體的去除
4.1.1 污染細(xì)胞和Mynox混合物的準(zhǔn)備
在直徑為6cm的無菌培養(yǎng)皿中，將污染細(xì)胞與Mynox混合
1. 加入2.8ml含有5%v/v胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基
2. 加入Mynox 200 µl（1管）
3. 加入2 ml 細(xì)胞密度為1x104至 1x105的污染細(xì)胞
混合物總體積為5ml。
注意：
1．確保對單一細(xì)胞進(jìn)行支原體殺除（顯微鏡下觀察!）。可根據(jù)需要延長胰酶消化時(shí)間。
2．在加入污染細(xì)胞前，確保Mynox®已被添加在培養(yǎng)基中。將污染細(xì)胞直接加入到Mynox混合物中。
4.1.2 去除支原體
在正常細(xì)胞培養(yǎng)的條件下，將Mynox與污染細(xì)胞的混合物進(jìn)行2個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)，然后，棄去上清液，再加入標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)基。將去除支原體后的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
注意：
在污染細(xì)胞去除支原體期間，應(yīng)經(jīng)常觀察Mynox對細(xì)胞的影響。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不佳，應(yīng)立即停止反應(yīng)，添加標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，將Mynox混合物按1:5稀釋。
4.2 懸浮細(xì)胞系支原體的去除
4.2.1 污染細(xì)胞和Mynox混合物的準(zhǔn)備
將污染細(xì)胞與Mynox混合在無菌離心管中
1. 加入1.6ml 0.125%的胰酶和5mM EDTA PBS緩沖液
2. 加入Mynox 200 µl（1管）
3. 轉(zhuǎn)移1.6 ml含有10%v/v胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和細(xì)胞密度為1x104至 1x105的污染細(xì)胞
混合物總體積為3.4ml。
注意：
1．確保對單一細(xì)胞進(jìn)行支原體殺除（顯微鏡下觀察!）?？筛鶕?jù)需要延長胰酶消化時(shí)間。
2．在加入污染細(xì)胞前，確保Mynox®已被添加在培養(yǎng)基中。將污染細(xì)胞直接加入到Mynox混合物中。
3．確保離心管中污染細(xì)胞與Mynox的混合物為液態(tài)。
胰酶可防止細(xì)胞聚集。如果，去除支原體過程中，不需要使用胰酶進(jìn)行細(xì)胞分離，可添加PBS緩沖液，以保證細(xì)胞與Mynox混合物的總體積為3.4 ml。
4.2.2 去除支原體
1. 室溫下，輕輕搖勻混合物2小時(shí)。
2. 將細(xì)胞團(tuán)離心5分鐘 （600 x g） 并棄去上清液。
3. 在不含Mynox的培養(yǎng)基中將細(xì)胞重懸。
去除支原體更有效的方法是：將污染細(xì)胞在含有Mynox的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1代。將污染細(xì)胞加入到5 ml含有5 % v/v 胎牛血清的培養(yǎng)基和150 µl Mynox的混合物中培養(yǎng)3天，然后，離心并棄去上清液，再繼續(xù)在不含Mynox的培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
注意：
在污染細(xì)胞去除支原體期間，應(yīng)經(jīng)常觀察Mynox對細(xì)胞的影響。如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不佳，應(yīng)立即停止反應(yīng)，添加標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，將Mynox混合物按1:5稀釋。
4.3 無包被病毒支原體的去除
4.3.1 污染細(xì)胞和Mynox混合物的準(zhǔn)備
凍存或新鮮的細(xì)胞以及不含細(xì)胞碎片的懸浮液均可進(jìn)行支原體殺除。病毒的滴度不影響去除效果，將污染細(xì)胞與Mynox混合在15ml無菌管中：
將污染細(xì)胞與Mynox混合在無菌離心管中
1. 加入1ml不含胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基
2. 加入Mynox 100 µl
3. 將125 µl病毒株和8%v/v的胎牛血清加入到上述混合液中
混合物總體積為1.225 ml。
注意：
確保反應(yīng)管中污染細(xì)胞與Mynox的混合物為液態(tài)。
4.3.2 去除支原體
1. 將污染細(xì)胞與Mynox的混合物室溫下培養(yǎng)2小時(shí)，并輕輕搖勻。
2. 在培養(yǎng)基中，將Mynox稀釋為1:10時(shí)，反應(yīng)結(jié)束。
在進(jìn)行此步驟時(shí)，可以通過去除宿主細(xì)胞系的支原體污染，同時(shí)達(dá)到去除病毒中支原體污染的目的。zui后的體積應(yīng)達(dá)到混合液體積的10倍。
注意：
在被支原體污染之前，首先要檢測宿主細(xì)胞系是否有支原體污染。
4.4 包被病毒支原體的去除
包被病毒外層的脂質(zhì)膜成分與支原體膜相似，也是Mynox結(jié)合的對象。根據(jù)使用Mynox的濃度和作用時(shí)間，這些病毒極易被Mynox殺除。為了能夠*殺除支原體，預(yù)殺除支原體的病毒的滴度應(yīng)高于106 TCID50。
4.4.1 污染細(xì)胞和Mynox混合物的準(zhǔn)備
凍存或新鮮的細(xì)胞以及不含細(xì)胞碎片的懸浮液均可進(jìn)行支原體殺除。將污染細(xì)胞與Mynox混合在15ml無菌管中：
1. 加入4.4ml不含胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基
2. 加入Mynox 100 µl
3. 將0.5 ml病毒株和8%v/v的胎牛血清加入到上述混合液中
混合物總體積為5 ml。
注意：
確保反應(yīng)管中污染細(xì)胞與Mynox的混合物為液態(tài)。
4.4.2 去除支原體
將污染細(xì)胞與Mynox的混合物室溫下培養(yǎng)2小時(shí)，并輕輕搖勻。在培養(yǎng)基中，將Mynox稀釋為1:10時(shí)，反應(yīng)結(jié)束。在進(jìn)行此步驟時(shí)，可以通過去除宿主細(xì)胞系的支原體污染，同時(shí)達(dá)到去除病毒中支原體污染的目的。zui后的體積應(yīng)達(dá)到混合液體積的10倍。
注意：
在被支原體污染之前，首先要檢測宿主細(xì)胞系是否有支原體污染。這個(gè)支原體去除過程，可多次用于病毒株的殺除，以確保所有支原體已被殺除。5. 支原體檢測
在不添加抗生素的情況下，經(jīng)Mynox去除的細(xì)胞培養(yǎng)物和病毒株應(yīng)繼續(xù)傳代培養(yǎng)4代，然后，進(jìn)行支原體污染的再測定。我們建議使用高敏感度的Venor®GeM支原體檢測試劑盒（Cat.-No. 11-1025/1050/1100/1250），以測定支原體去除的效果。該試劑盒應(yīng)用的PCR檢測法，但是，去除支原體后，不宜立即采用PCR檢測。因?yàn)椋?/span>Mynox可改變支原體膜的通透性，使支原體破裂死亡，進(jìn)而，達(dá)到殺除支原體的目的，同時(shí)，支原體DNA也會釋放到培養(yǎng)基中，此時(shí)，應(yīng)用PCR法檢測，就可檢到支原體DNA，從而，造成錯(cuò)誤的陽性結(jié)果。在繼續(xù)傳代培養(yǎng)1-2代后，由于培養(yǎng)基的更換，細(xì)胞外不再含有支原體DNA。
