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這有一份FFPE樣本建庫(kù)的檔案，還不趕緊Pick?

• 什么是FFPE？

FFPE（Formalin-Fixed and Parrffin Embedded），即福爾馬林固定石蠟包埋樣本。由于這種處理方法能夠較長(zhǎng)時(shí)間地保存組織或制備檢驗(yàn)所需的組織標(biāo)本，所以在臨床病理檢驗(yàn)、腫瘤基因檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。在世界范圍內(nèi)，大約有數(shù)十億份組織樣品保存在醫(yī)院或者組織樣品庫(kù)中，其中絕大多數(shù)是使用福爾馬林固定石蠟包埋的方法處理的樣品。

FFPE樣本通常代表了珍貴且來(lái)源廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究材料，為闡明疾病機(jī)制、回顧性研究等提供了寶貴的資源，但是由于樣本制備以及儲(chǔ)存等多方面的原因，F(xiàn)FPE樣本中的DNA質(zhì)量往往很差。所以如何通過(guò)FFPE樣本中獲得的DNA建立合格的文庫(kù)已成為當(dāng)前測(cè)序研究領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

圖1 FFPE樣本

• 為何FFPE樣本中的核酸質(zhì)量差？

FFPE樣本特殊的制作方法和保存過(guò)程都會(huì)對(duì)核酸分子造成多方面的影響。組織醫(yī)學(xué)樣本在離體后即開始發(fā)生降解，福爾馬林的固定使組織中的核酸與核酸或核酸與蛋白之間交聯(lián)，石蠟的滲入過(guò)程進(jìn)一步加速核酸的降解，保存時(shí)間及環(huán)境對(duì)樣品中的核酸也有極大的影響。上述這些原因蕞終導(dǎo)致樣本中的核酸質(zhì)量受到嚴(yán)重的干擾和影響，比如假陰性和假陽(yáng)性。其中假陽(yáng)性的出現(xiàn)對(duì)于基因檢測(cè)，尤其是低頻突變的檢測(cè)會(huì)造成很大的干擾。

表1 影響FFPE樣本中DNA質(zhì)量的主要因素

• 如何提高FFPE樣本的建庫(kù)質(zhì)量？

1. 樣本質(zhì)量控制

對(duì)于高質(zhì)量的DNA樣本，通過(guò)吸光度檢測(cè)樣品純度（Nanodrop）和熒光定量（Qubit）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)即可，但是這對(duì)于FFPE樣本來(lái)源的DNA是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的， 需要進(jìn)一步的質(zhì)控評(píng)估。目前主要的方法有以下兩種：

1）通過(guò)對(duì)廣泛存在于gDNA的Alu序列（Alu 247與Alu 115）的qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物比值來(lái)衡量DNA的完整性；

注：Alu247/Alu115：Alu序列是廣泛分布于人基因組的約300bp短重復(fù)序列。通過(guò)長(zhǎng) (247 bp; Alu247) 、短(115 bp; Alu115) 擴(kuò)增子比值可評(píng)估gDNA的完整度。

              Q Score：即Quality Score，是指不同qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度的比值。常用的Q129/Q41和Q305/Q41比值分別指129bp和41bp產(chǎn)物、305bp和41bp產(chǎn)物濃度比值。

2) DIN：即 DNA Integrity Number，是指DNA經(jīng)安捷倫生物分析系統(tǒng) 2200/4200 TapeStation分析并計(jì)算的出的數(shù)值，是對(duì)DNA完整性的評(píng)分。

表2 FFPE樣本質(zhì)控參數(shù)

2. 樣本損傷修復(fù)

FFPE樣本由于制作與儲(chǔ)存等多方面的原因?qū)е聵颖举|(zhì)量不佳，如果質(zhì)控之后樣本質(zhì)量很差，可對(duì)樣本DNA進(jìn)行修復(fù)。通常修復(fù)液由不同的酶類根據(jù)不同比例混合而成，能夠?qū)NA樣本中胞嘧啶脫氨成尿嘧啶、切刻或者缺口等問(wèn)題能夠進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而從整體上提升建庫(kù)成功率。

表3 FFPE 修復(fù)試劑作用

通常情況下，F(xiàn)FPE修復(fù)試劑可以通過(guò)對(duì)樣本的修復(fù)顯著提高低質(zhì)量FFPE樣本的建庫(kù)產(chǎn)出，而對(duì)高質(zhì)量FFPE樣本的建庫(kù)產(chǎn)量提升并不明顯（如下圖所示）。

圖2 FFPE修復(fù)試劑盒對(duì)建庫(kù)產(chǎn)量的影響（Input DNA: 10 ng; Cycles：10）

數(shù)據(jù)來(lái)源于翊圣Ultima^TM DNA建庫(kù)試劑盒（Cat12199）測(cè)試結(jié)果，F(xiàn)FPE修復(fù)試劑為翊圣FFPE DNA Repair Reagent(Cat#12606)

3. 樣本建庫(kù)

的建庫(kù)試劑盒能夠蕞大程度的利用有限的樣本，使其轉(zhuǎn)化為合格的文庫(kù)。FFPE樣本由于樣本濃度更低，質(zhì)量較差，往往對(duì)試劑盒的要求也更高，搭配更的建庫(kù)試劑盒也成為了FFPE樣本建庫(kù)的*之選。

建庫(kù)試劑盒的效率評(píng)估指標(biāo)主要3個(gè)方面：

NGS建庫(kù)文庫(kù)轉(zhuǎn)化率：指文庫(kù)中兩端都連上接頭的目的片段占總片段數(shù)的比值。文庫(kù)轉(zhuǎn)化率影響文庫(kù)的多樣性與文庫(kù)的質(zhì)量，高的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率一定程度上意味著文庫(kù)豐度與測(cè)序的覆蓋度更好，尤其是在FFPE樣本中可能出現(xiàn)一些其他類型損傷的情況下，轉(zhuǎn)化率過(guò)低勢(shì)必會(huì)影響蕞終文庫(kù)的產(chǎn)出與文庫(kù)的豐度。

圖3 雙端連接的文庫(kù)通過(guò)橋式擴(kuò)增成簇

文庫(kù)擴(kuò)增均一性：指的是讀取數(shù)據(jù)在基因組或目標(biāo)區(qū)域的分布均一程度。其生信分析圖如圖4所示，一般認(rèn)為覆蓋越均勻，達(dá)到特定深度所需的測(cè)序數(shù)據(jù)就越少，覆蓋均一性的偏向通常是在DNA片段化和文庫(kù)擴(kuò)增步驟中引入的。

圖4 不同GC含量樣本測(cè)序數(shù)據(jù)均一性

文庫(kù)擴(kuò)增效率與保真性：文庫(kù)擴(kuò)增效率即獲得特定文庫(kù)產(chǎn)量所需的循環(huán)數(shù)，循環(huán)數(shù)越低意味著擴(kuò)增效率越高；保真性即PCR擴(kuò)增中出現(xiàn)堿基錯(cuò)配的數(shù)量，相同循環(huán)數(shù)條件下，錯(cuò)配數(shù)量少則保真性越高。

• 十年匠心品質(zhì)，只為一顆初心——Ultima^TM，就是你要的檔案

Hieff NGS^® Ultima DNA Library Prep Kit（Cat#12199）是翊圣生物針對(duì)Illumina測(cè)序平臺(tái)研發(fā)的DNA建庫(kù)試劑盒，本品采用高質(zhì)量酶學(xué)組成，具有優(yōu)異的文庫(kù)轉(zhuǎn)化率與擴(kuò)增效率，*解決FFPE/cfDNA建庫(kù)難的問(wèn)題。多樣本驗(yàn)證，同等條件下文庫(kù)產(chǎn)量是K*品牌的1-3倍。適用于常規(guī)動(dòng)植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等所有樣本建庫(kù)，助力獲得優(yōu)異的測(cè)序數(shù)據(jù)。

精簡(jiǎn)流程：末端修復(fù)與A尾巴添加一步完成，無(wú)需純化，大大縮減建庫(kù)時(shí)間；

極的DNA連接酶： 自主創(chuàng)新研發(fā)DNA連接酶Fast T4 DNA Ligase，多樣本驗(yàn)證連接效率是N*品牌的2-3倍；

強(qiáng)擴(kuò)增效率的高保真酶：自主創(chuàng)新研發(fā)強(qiáng)擴(kuò)增效率高保真酶Canace^®Ⅱ，極大降低文庫(kù)擴(kuò)增帶來(lái)的偏好性。性能媲美K*品牌H*Fi酶；

圖5 Ultima^TM建庫(kù)試劑盒多樣本驗(yàn)證均可獲得優(yōu)異的文庫(kù)質(zhì)量

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