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小翊君前幾期一直在和大家聊qPCR，今天我們開啟一個新的話題，聊一聊反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）定義:

反轉(zhuǎn)錄過程簡單來說是以RNA為模板合成DNA的過程，是對中心法則的重要修正和補充。
 

中心法則

    通常會出現(xiàn)兩個不同的表述，逆轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄，二者的本質(zhì)區(qū)別在于：反轉(zhuǎn)錄是在研究過程中人為提取RNA并以之為模板人工合成DNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄是RNA病毒自主行為，以RNA為模板形成DNA的過程。前者發(fā)生在體外，后者發(fā)生在體內(nèi)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的示意圖如下圖所示：
 

反轉(zhuǎn)錄實驗過程

   看似簡單的反轉(zhuǎn)錄實驗，但也受到多種因素的影響，如模板、引物、酶以及反應(yīng)條件等。接下來小編將帶您對其各個擊破。

一、模板
 

① RNA自身結(jié)構(gòu)（高GC、復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)）

RNA由于自身序列折疊，具有不同復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)：配對的雙鏈RNA呈螺旋，發(fā)卡環(huán)，突環(huán)，內(nèi)環(huán)，多分支環(huán)等結(jié)構(gòu)。由于配對堿基不同，其配對的穩(wěn)性也不同，如G與C之間的配對，三對氫鍵，為穩(wěn)定。A與U為兩對氫鍵相互作用；G與U為一對氫鍵相互作用，不穩(wěn)定。故對于RNA模板來講，GC含量越高，二級結(jié)構(gòu)越為復(fù)雜。

在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的過程中，如下圖所示，當(dāng)引物延伸到有二級結(jié)構(gòu)的地方，反應(yīng)就會被迫終止，影響cDNA的合成長度。此時可建議先將模板進(jìn)行65℃孵育5min然后迅速冰上冷卻使二級結(jié)構(gòu)變性；同時可通過在較高的溫度下（如55℃）反應(yīng)以降低RNA二級結(jié)構(gòu)的形成。
 

反轉(zhuǎn)錄實驗延伸過程

② 純度和濃度的測定
 

RNA純度會很大程度地影響反轉(zhuǎn)錄實驗，如RNA純化過程中混入的鹽、金屬離子、乙醇、苯酚等均是常見的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。此外植物組織中的多糖多酚和腐殖酸等也會對逆轉(zhuǎn)錄酶造成抑制作用。

對于RNA純度的測定，通常會選用Nano drop進(jìn)行測定。純度完好的RNA：1.8＜OD260/OD280＜2.0（＜1.8時表明有蛋白質(zhì)或酚污染，可增加酚抽提；＞2.0時表明可能有異硫氰酸殘存）；OD260/OD230應(yīng)大于2。（＜2表明有異硫氰酸胍，β-巰基乙醇或乙醇的殘留；可進(jìn)行再次沉淀，重復(fù)乙醇洗滌）。

對于RNA濃度的測定，通常也會選用Nano drop進(jìn)行測定。

③ 完整度
 

RNA的完整度在很大程度上影響著cDNA合成的長度與質(zhì)量。在進(jìn)行RNA提取處理儲存和實驗過程中需要采取特殊的保護(hù)措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用無RNA酶污染的實驗耗材等。

對于下游的克隆實驗，RNA完整度將會影響cDNA的合成長度，從而影響目的基因的合成。對于下游的目的基因定量實驗，將會嚴(yán)重影響其CT值，從而影響定量結(jié)果度（見下圖）。
 

RNA RIN值和CT值的關(guān)系

     RNA的完整度通常會通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，對于28S和18S rRNA的比值來評估RNA的完整度，接近2:1為較為完整的RNA。

目前，Agilent 2100生物分析儀已逐漸成為RNA樣品質(zhì)量控制（QC）的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，在分析RNA完整性之后給出準(zhǔn)確的數(shù)值（RIN值），該值在8-10之間表示RNA質(zhì)量非常好，小于7時表示RNA完整度較差。

④ gDNA的去除
 

在進(jìn)行下游qPCR實驗過程中Totol RNA中混入的gDNA可直接作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴增，造成實驗結(jié)果的假陽性。因此在反轉(zhuǎn)錄之前必須要對RNA模板進(jìn)行去gDNA處理，保證模板中僅有cDNA。

那么如何解決呢？

我們可通過加入DNaseⅠ去除gDNA。但是在反轉(zhuǎn)錄實驗前需將DNaseⅠ滅活（通過高溫加熱或加入EDTA），否則該酶會將cDNA降解，但是高溫滅活DNaseⅠ會造成RNA的降解和損失，加入EDTA滅活又會引入新的RNA酶抑制劑。

Yeasen生物提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒含gDNA digester組分，在反轉(zhuǎn)錄之前可將其與RNA模板混勻42℃，2min即可去除gDNA組分，同時此試劑盒中的SuperMix 可終止gDNA digester的作用，保證cDNA的完整性。

二、引物
 

① Oligo(dT)

    Oligo(dT)引物是約12-18個多聚胸腺嘧啶T組成的重復(fù)寡核苷酸序列，能夠特異性地與真核生物mRNA的ploy(A)尾退火，故不適合缺少ploy(A)尾結(jié)構(gòu)的RNA，如原核生物RNA或microRNA，也不適用于已降解的RNA，如FFPE樣品中RNA。

真核生物中mRNA僅占總RNA的1%-5%左右，通常在進(jìn)行從真核生物中構(gòu)建cDNA文庫，或者克隆全長cDNA以及3’RACE等研究時會優(yōu)先選擇 Oligo(dT)引物。

對于復(fù)雜模板RNA，如含較多二級結(jié)構(gòu)，在進(jìn)行cDNA的合成延伸過程中，當(dāng)延伸到二級結(jié)構(gòu)處時，可能會造成延伸終止，若選擇Oligo(dT)可能會造成mRNA 5’端信息的丟失。

② Random N6-N9
 

隨機引物是由隨機堿基組成的寡核苷酸，通常由6個核苷酸組成，稱為隨機6聚體。該種引物不具備特異性，rRNA, tRNA,非編碼RNA，小RNA，降解RNA，復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA等都可以作為其模板。該類引物可提高cDNA的產(chǎn)量和濃度，但是會使合成的cDNA長度變短。

③ 基因特異性引物
 

基因特異性引物能夠與模板特異性互補，產(chǎn)生目標(biāo)性很強的cDNA，對于后續(xù)的PCR擴增更特異，適用于已知目的序列。通常應(yīng)用于一步RT-PCR反應(yīng)。當(dāng)使用基因特異性引物（GSP）無法有效合成鏈cDNA時，可選用Oligo(dT)或隨機引物。

三、酶
 

不同的逆轉(zhuǎn)錄酶具有不同的功能活性，表現(xiàn)出不同的逆轉(zhuǎn)錄效率，如合成cDNA的長度，產(chǎn)量，對復(fù)雜模板的適應(yīng)程度等。通常共有的活性如下：

1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合形成DNA的過程。

2）RNaseH活性：在反應(yīng)過程中切割RNA：cDNA雜合鏈中的RNA模板。降低此活性，可避免在合成較長cDNA之前模板RNA被降解掉。

3）DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以反轉(zhuǎn)錄合成的條cDNA單鏈為模板，再合成第二條cDNA分子。

4）熱穩(wěn)定性：此性能是影響cDNA合成的重要因素。升高反轉(zhuǎn)錄過程中的溫度，有助于高GC或復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)RNA模板的變性，實現(xiàn)全長cDNA的合成。

5）保真性：RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA過程中的序列度。由于逆轉(zhuǎn)錄酶不具備3’-5’外切酶活性，因此沒有校正功能，所以合成的cDNA出錯率較高。通常，除測序?qū)Χ纫筝^高外，其他情況下，反轉(zhuǎn)錄中引入的錯誤數(shù)量可忽略不計，因為cDNA中的錯誤不會被放大。

6）抗抑制能力：當(dāng)模板純度較低、抑制物較多時，抗抑制能力強的逆轉(zhuǎn)錄酶才能正常進(jìn)行cDNA的合成。

目前使用的逆轉(zhuǎn)錄酶大都為MMLV（來源于莫洛尼鼠白血病病毒）。未經(jīng)改造的MMLV適反應(yīng)溫度為37℃，有較低的RNaseH活性。Yeasen生物對MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行改造，提高其適反應(yīng)溫度（高溫下有利于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開），降低RNaseH活性，提高cDNA合成長度，增強其靈敏度和耐抑制能力。改造結(jié)果見下圖：

 

逆轉(zhuǎn)錄酶的改造

各種逆轉(zhuǎn)錄酶的性能參數(shù)如下表：
 

反應(yīng)過程
 

反轉(zhuǎn)錄溫度通常推薦使用42℃，對于高GC含量模板或者復(fù)雜模板，可將反轉(zhuǎn)錄溫度提高到50℃。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于qPCR反應(yīng)，也可-20℃短期保存；若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

總之，率的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)建立在高質(zhì)量的RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄酶，合適的引物，適宜的反應(yīng)條件等基礎(chǔ)上的。實驗過程中要注意到所有的影響因素，才能合成出適用于下游實驗的高質(zhì)量cDNA。

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