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有時(shí)候，qPCR實(shí)驗(yàn)會(huì)成為阻礙你課題順利開展的強(qiáng)勢攔路虎！看似簡單的基因表達(dá)量差異驗(yàn)證，當(dāng)遇到低豐富表達(dá)的基因時(shí)，也許就舉步維艱。模板獲取困難導(dǎo)致的RNA提取量少或RNA質(zhì)量不佳，即使選用蕞佳的試劑、篩選出良好的引物，也有可能qPCR定量得到的內(nèi)參基因CT值在18-20個(gè)cycle，而目的基因在31-35個(gè)循環(huán)。遇到這種情況，你是怎么解決的呢？
qPCR在低豐度表達(dá)基因定量中的局限性
基因的豐度是指基因在基因組中的拷貝數(shù)。可分為高豐度，中等豐度和低豐度。低豐度是指目的基因在基因組中的拷貝數(shù)低,可簡單認(rèn)為2ng 總RNA中低于100個(gè)拷貝數(shù)的基因。從qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果來講，當(dāng)擴(kuò)增效率為*，模板加入量在1-10ng范圍內(nèi)，qPCR得到的CT值高于28時(shí)即可認(rèn)為低豐度基因,如下表所示。
對低豐度表達(dá)和超低豐度表達(dá)的基因進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)難點(diǎn)：一是如何保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性；二是如何對得到的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
如何定量好低豐度目的基因？
定量結(jié)果的準(zhǔn)確性需要依賴定量實(shí)驗(yàn)的合理設(shè)計(jì)。低豐度基因定量實(shí)驗(yàn)常常出現(xiàn)以下情況：樣品復(fù)孔間重復(fù)性差（見下圖）、PCR擴(kuò)增效率低不能有效反映或接近基因的實(shí)際表達(dá)量。
一、如何保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性
a. 保證復(fù)孔間的重復(fù)性
低拷貝基因在總RNA中的分布極不均勻，容易引起復(fù)孔間的誤差，造成重復(fù)性差。
建議：
1、在保證儀器等設(shè)備校準(zhǔn)的情況下，可以增加cDNA的稀釋倍數(shù)，增加上樣體積，減少移液誤差；
2、增加復(fù)孔數(shù)，對偏差較大的數(shù)值予以舍棄；
3、還有一種方法就是引入一種不相關(guān)的carrier DNA(or RNA), 這些物質(zhì)不跟目標(biāo)基因發(fā)生反應(yīng)，不干擾基因的檢測，減少移液過程中靶基因粘壁或槍頭的損耗。
b. 保證引物的擴(kuò)增效率
qPCR擴(kuò)增效率的要求是在90-110%。理論上，每對引物均需要預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線確認(rèn)擴(kuò)增效率，說到底qPCR反應(yīng)包含模板，引物和反應(yīng)試劑，因此可從以下角度優(yōu)化擴(kuò)增效率：
1、模板質(zhì)量的要求：模板純度低，含抑制劑會(huì)抑制PCR擴(kuò)增，不利于qPCR實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。模板發(fā)生降解，引物無法有效退火到目標(biāo)區(qū)域，也會(huì)造成擴(kuò)增效率下降。高質(zhì)量的模板從來都是進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)的要求之一！
2、優(yōu)化引物設(shè)計(jì)：常見的引物設(shè)計(jì)原則可自行百度。非特異性擴(kuò)增會(huì)競爭消耗引物和Taq酶，也會(huì)降低目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率。引物二聚體可參照下一條介紹。
3、引物濃度優(yōu)化：引物濃度高，模板濃度過低，會(huì)引起引物二聚體的形成。對于低豐度基因而言，引物二聚體與SYBR Green I結(jié)合產(chǎn)生的熒光，會(huì)干擾背景值，造成試劑檢測靈敏度下降！
4、試劑的選擇：選用特異性好，檢測靈敏度高的qPCR預(yù)混液。當(dāng)然，相對于二步法qPCR定量而言，選取一步法RT-qPCR無疑會(huì)有更好的靈敏度，該方法將反轉(zhuǎn)錄和qPCR置于一管，增加了檢測的靈敏度。
二、如何對定量結(jié)果進(jìn)行分析
下面我們從擴(kuò)增效率角度和內(nèi)參基因與目的基因△CT值的差異進(jìn)行解釋低豐度基因定量數(shù)據(jù)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。
a.當(dāng)內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增效率一致，且擴(kuò)增效率均接近100%：
1、內(nèi)參基因和目的基因的△CT值相差較大時(shí)，如內(nèi)參基因Ct值在20，目的基因Ct值在32。
當(dāng)遇到以上情況，且實(shí)驗(yàn)的樣本材料較或RNA純化量較少，可考慮以下分析方法。
首先構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定TNF（目的基因）和HPRT（內(nèi)參基因）擴(kuò)增效率，如下表。
由上表可以看出，內(nèi)參基因與目的基因的△Ct值相差均勻，表明擴(kuò)增效率接近。
當(dāng)研究“Jurkat cells were untreated or treated with PMA”，TNF表達(dá)量計(jì)算如下表：
可以看出，以上數(shù)據(jù)直接按照正常的△△Ct法分析即可。該分析方法的前提是qPCR試劑可準(zhǔn)確定量超低濃度模板量。
2、內(nèi)參基因和目的基因的△CT值相差較?。ㄟm用于樣本RNA量多時(shí)）
當(dāng)選用的qPCR試劑檢測范圍較小時(shí)，對低濃度模板不能準(zhǔn)確定量，可增加模板加入量，使內(nèi)參基因和目的基因均在試劑檢測的有效范圍。此時(shí)的關(guān)鍵在于選擇表達(dá)豐度和目的基因相近的內(nèi)參基因。內(nèi)參基因的選擇依據(jù)有二：一是不受作用因素的影響且表達(dá)量相對恒定；二是選取多個(gè)內(nèi)參基因，均一化誤差。下表列舉了常見的內(nèi)參基因，豐度從高到低，根據(jù)目的基因表達(dá)豐度選取1-3個(gè)進(jìn)行對照校正。
b.內(nèi)參基因和目的基因的擴(kuò)增效率不一致，但均在90%-110%之間——雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法
利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。
HB180724
