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近年來，造成人類感染的病原微生物日益復(fù)za，種類增多，抗菌藥物濫用致使細(xì)菌耐藥，病原微生物已成為關(guān)注的焦點(diǎn)。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，在中國，感染性疾病占所有疾病的50%以上，造血系統(tǒng)腫瘤患者、實(shí)體腫瘤患者和膿毒癥（嚴(yán)重感染）患者病死率均高達(dá)50%以上。面對重癥感染患者，能否快速確認(rèn)感染病原體，成為后續(xù)對癥治療的關(guān)鍵，基于宏基因組新一代測序技術(shù)（metagenomics next-generation sequencing, mNGS）為解決這一問題提供了一個可能的突破方向。
一、mNGS簡述
1.mNGS概述
宏基因組學(xué)（Metagenomics）概念早是在1998年由威斯康辛大學(xué)植物病理學(xué)部門的Jo Handelsman等提出的，是源于將來自環(huán)境中基因集可以在某種程度上當(dāng)成一個單個基因組研究分析的想法。后來伯克利分校的研究人員Kevin Chen和Lior Pachter將宏基因組定義為“應(yīng)用現(xiàn)代基因組學(xué)的技術(shù)直接研究自然狀態(tài)下的微生物的有機(jī)群落，而不需要在實(shí)驗(yàn)室中分離單一的菌株"的科學(xué) 。
圖 微生物群落測序圖譜
2.mNGS檢測的特點(diǎn)
隨著基因測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于二代測序的mNGS成為了臨床的焦點(diǎn)。不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，直接對臨床樣本中的核酸進(jìn)行高通量測序，然后與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，根據(jù)比對到的序列信息來判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速、客觀的檢測臨床樣本中的較多病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲），且無需特異性擴(kuò)增，尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷。
3.mNGS檢測病原的分類
在急危重癥感染中，患者往往因?yàn)檫z傳性疾病、腫瘤、營養(yǎng)不良、器官yi植、藥物等因素導(dǎo)致免疫缺陷，除了遭受普通感染外，尤其容易受到機(jī)會性感染，即條件致病菌引起的感染。這類感染涉及的微生物種類復(fù)雜，很難根據(jù)經(jīng)驗(yàn)提前預(yù)判，常規(guī)檢測方法無法覆蓋。相比之下，mNGS理論上可以報(bào)告所有已知基因組序列的病原體，目前已經(jīng)納入的病原體有18000多種，其中包括9694余種細(xì)菌、6760余種病毒、1551余種真菌和305種寄生蟲。
二、mNGS操作流程
mNGS的檢測流程可以大致分為5個步驟：核酸提取、文庫構(gòu)建、上機(jī)測序、生信分析與報(bào)告解讀。文庫構(gòu)建的目的在于給未知序列的核酸片段兩端加上已知序列信息的接頭以便于測序，單樣本文庫構(gòu)建完成后需要經(jīng)歷PCR擴(kuò)增、再將多個文庫樣本混合后進(jìn)行測序。測序完成后，數(shù)據(jù)會自動進(jìn)入搭建好的病原體自動分析流程，該流程包括去除人源宿主序列和低質(zhì)量序列、以及微生物數(shù)據(jù)庫比對注釋等步驟。后，解讀專家根據(jù)自動化系統(tǒng)產(chǎn)生的初步結(jié)果，再結(jié)合部分臨床指標(biāo)、樣本類型、病原體種類等因素進(jìn)行綜合分析解讀。
圖 mNGS檢測流程圖
圖片來自國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心副主任李金明 報(bào)告
三、臨床病原體檢測方法比較
傳統(tǒng)的檢測方法主要有涂片鏡檢，生化反應(yīng)和免疫學(xué)檢測等等，但存在周期長、過程復(fù)雜以及靈敏度低等特點(diǎn)。PCR技術(shù)的出現(xiàn)部分解決了上述的問題，但是難以解決未知微生物檢測的難題。而NGS檢測無需對病原體進(jìn)行分離培養(yǎng)，也不依賴于已知的核酸序列設(shè)計(jì)引物等，可直接對標(biāo)本進(jìn)行測序鑒別，大大縮減建庫時間，提高診斷效率，尤其在未知病原微生物檢測方面有的優(yōu)勢。
四、mNGS在病原檢測中的優(yōu)勢與挑戰(zhàn)
mNGS作為二代測序成本快速降低而興起的一門全新領(lǐng)域，若用于體外診斷試劑的研發(fā)，有其不可替代的優(yōu)勢，但同時也存在很多挑戰(zhàn)，本文初步總結(jié)如下：
根據(jù)以上的對比我們發(fā)現(xiàn)：mNGS在病原檢測上暫時無法實(shí)現(xiàn)大范圍推廣、快速診斷的目的。但未來，隨著mNGS自動化程度的提高，以及檢測成本的進(jìn)一步降低，mNGS的臨床應(yīng)用將會更加成熟，在病原體核酸檢測中也將發(fā)揮更重要的作用。
五、明星產(chǎn)品推薦
產(chǎn)品名稱：Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for Illumina®
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1）實(shí)驗(yàn)流程更精簡：片段化/末修/加A一步完成，大大縮減建庫時間；
2）樣本適用范圍廣：適用于痰液，腹水，腦脊液，F(xiàn)FPE等各類樣本；
3）適用場景更廣泛：自動化建庫平臺首xuan；
4）酶切可控時間長：僅需調(diào)整酶切時間即可得到目標(biāo)片段；
5）耐抑制物能力強(qiáng)：對于復(fù)雜樣本中的一些抑制物有更好的耐受能力。
性能展示：不同模板的質(zhì)量不均一，采用不同的酶切時間可獲得優(yōu)質(zhì)文庫。
產(chǎn)品信息
名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 價格 | * |
Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12204ES08/24/96 | 8/24/96 T | 3683/7583/28663 | 2210/4550/17198 |
Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12206ES08/24/96 | 8/24/96 T | 2355/6155/23855 | 1531/4001/15506 |
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參考文獻(xiàn)：
【1】 Itai Sharon and Jillian F. Banfi eld.Genomes from Metagenomics.Science,2013,342:1057-1058.
【2】宋振舉等.宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識.中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2019, 28(2):151-155.
【3】陶悅,傅啟華,莫茜.病原宏基因組測序在病毒檢測中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)[J] .中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2020,43( 00 ): E008-E008. DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2020.0008
