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Uracil DNA Glycosylase, Heat-Labile高效預(yù)防PCR氣溶膠污染

——酶活高效，活性可控

操作環(huán)境中的氣溶膠污染是造成PCR結(jié)果假陽(yáng)性zui常見(jiàn)的因素。美國(guó)科學(xué)家Lindahl早在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了UDG酶（Uracil DNA Glycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶），利用UDG酶選擇性水解含dU的DNA單鏈或DNA雙鏈的機(jī)制，巧妙地引入dUTP取代PCR體系中的dTTP而構(gòu)成了dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)。穩(wěn)定使用該系統(tǒng)， 可有效消除PCR體系中混入的擴(kuò)增殘留污染物（多以氣溶膠形式存在），保證擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。

作用原理

dUTP/UDG酶是作為PCR反應(yīng)體系的配制成分發(fā)揮防污染作用的。作用原理是dUTP使得每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)生成的PCR產(chǎn)物成為含有dU的DNA鏈。為防止此前積累的殘留產(chǎn)物作為模板干擾擴(kuò)增反應(yīng)，在新擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行時(shí)，一定溫度下，UDG酶選擇性的催化水解dU-DNA鏈中的尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架的N-糖苷鍵，釋放出游離的尿嘧啶，形成有缺失堿基的DNA鏈。經(jīng)95℃高溫進(jìn)一步水解斷裂，從而消除污染。同時(shí)高溫使得UDG酶失去活性，不會(huì)水解新的dU-DNA鏈（見(jiàn)圖1）。

天然的、未經(jīng)修飾的DNA不含dU，不受UDG酶影響，繼續(xù)作為PCR/qPCR擴(kuò)增的模板進(jìn)行擴(kuò)增。

圖1. dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)去除殘留擴(kuò)增污染物示意圖

產(chǎn)品特性

Uracil DNA Glycosylase (UDG), Heat-Labile是來(lái)源于嗜冷海洋細(xì)菌，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)純化的重組蛋白，在25-37℃發(fā)揮活性，熱敏感，50℃ 10 min或95℃ 2 min即發(fā)生不可逆滅活?？膳c熱啟動(dòng)Taq酶搭配使用，保證擴(kuò)增的特異性。

①10 U本品經(jīng)E.coli 16S rDNA特異性的TaqMan qPCR檢測(cè)，E.coli基因組殘留低于10拷貝。

②無(wú)核酸內(nèi)外切酶和RNase殘留。

③尿嘧啶是此酶識(shí)別的唯—堿基。

dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)使用方法（僅供參考）

1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，dUTP終濃度可在0.2-0.6 mM 之間調(diào)整，并選擇性摻入0.2 mM dTTP。

2. 體系中添加UDG酶，添加量1 個(gè)單位足矣。1單位可以30min內(nèi)消化1μg dU-DNA。

3. PCR反應(yīng)程序前加上25℃-37℃ 2-10min的保溫步驟活化UDG酶活性。

4. 正常進(jìn)行后續(xù)PCR程序。

效果展示

圖2. 0.05U、0.025U、0.0125U、0.00625U、0.003125U 熱敏UDG酶與360ng 200bp dU-DNA在25℃孵育30min（95℃ 2min滅活）。電泳檢測(cè)熱敏UDG酶的降解效果，可以看出0.025U的熱敏UDG就可*消化dU-DNA。

應(yīng)用場(chǎng)景

氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，在氣體與液體面摩擦?xí)r（如在渦旋振蕩后未離心直接開(kāi)蓋，移液槍反復(fù)吹吸樣品、PCR結(jié)束后開(kāi)蓋等）易形成。在分子實(shí)驗(yàn)室中，因頻繁進(jìn)行上述操作，并長(zhǎng)期進(jìn)行某些特定基因的擴(kuò)增易出現(xiàn)氣溶膠污染。

PCR是一種指數(shù)擴(kuò)增微量基因片段的核酸檢測(cè)技術(shù)，靈敏度*。PCR反應(yīng)體系中極微量的污染物即可引起假陽(yáng)性結(jié)果。因反應(yīng)成分多樣，若體系中存在氣溶膠污染物，假陽(yáng)性的原因不易排查，也很難解決。

dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)可zui大程度的保證PCR、qPCR、RT-qPCR、RPA等核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

除此之外，該系統(tǒng)還可用于定點(diǎn)突變克隆、二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。

FAQ

Q1: UDG酶可以用于已存在的擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染嗎？
A: 已存在的擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染不含dU，此時(shí)UDG酶不能發(fā)揮作用。建議選取其他擴(kuò)增區(qū)域，重新設(shè)計(jì)引物，并建立dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)，即可避免“未來(lái)”的氣溶膠污染。

Q2: dUTP會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的dU-DNA在雜交、測(cè)序、克隆和酶切等方面的下游應(yīng)用嗎？

A：含dU的PCR產(chǎn)物可正常進(jìn)行核酸雜交和測(cè)序，效果與常規(guī)PCR產(chǎn)物無(wú)差別。在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，連接產(chǎn)物需使用UDG酶缺失的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒擴(kuò)增。酶切實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)EcoRI和BamHI不受dU影響，但HindIII酶切效率有所降低，更多內(nèi)切酶效果還需自行嘗試。

Q3: 含dU的PCR產(chǎn)物后續(xù)做了連接和轉(zhuǎn)化，無(wú)克隆，這是什么原因？

A: 需要特別注意在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，連接產(chǎn)物需使用UDG酶缺失的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和后續(xù)的質(zhì)粒擴(kuò)增。

Q4: UDG酶用于RT-qPCR或RT-PCR體系時(shí)，會(huì)干擾逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)嗎？
A: 可選用耐受性能良好的逆轉(zhuǎn)錄酶，如Hifair III Reverse Transcriptase  *作用溫度50-55℃，此時(shí)熱敏UDG酶活性極低。

Q5: UDG酶會(huì)切割RNA嗎？

A: 不會(huì)。在生物體內(nèi)，UDG酶在DNA修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。它可以修復(fù)dC脫氨基形成dU的突變，進(jìn)而避免GC堿基對(duì)突變?yōu)锳T堿基對(duì)的可能。

Q6: UDG酶反應(yīng)Buffer是什么？

A:UDG酶可以在各類緩沖液中發(fā)揮作用，如常規(guī)的Taq酶Buffer、連接酶Buffer、酶切Buffer等。

Q7: UDG酶對(duì)DNA鏈的堿基個(gè)數(shù)有要求嗎？

A: 不能從6堿基或更少的寡核苷酸上水解尿嘧啶。

產(chǎn)品訂購(gòu)

注：上述產(chǎn)品庫(kù)存長(zhǎng)期均保留有多個(gè)批次以備測(cè)試。

注：上述產(chǎn)品庫(kù)存充足，該類產(chǎn)品已有多家IVD企業(yè)購(gòu)買用于生產(chǎn)用途。

HB200331