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溶酶體探針（LysoTracker & LysoSensor）
——酸性細(xì)胞器示蹤劑
背景介紹
溶酶體是一種分解蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的細(xì)胞器。溶酶體具單層膜囊狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含60余種酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶等，分解各種外源和內(nèi)源的大分子物質(zhì)。溶酶體水解酶的適pH為3.5~5.5，溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境是依靠膜上的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(H泵)來(lái)維持的。溶酶體標(biāo)志酶為酸性磷酸酶，目前針對(duì)溶酶體的定位也主要圍繞酸性磷酸酶展開(kāi)。
圖1.溶酶體結(jié)構(gòu)
溶酶體功能
溶酶體存在著形態(tài)上的多樣性和異質(zhì)性，根據(jù)溶酶體處于完成其生理功能的不同階段， 大致分為以下幾種：
圖2.溶酶體分類(lèi)及功能
溶酶體的主要功能是消化作用，主要通過(guò)三種途徑消化底物：1.自體吞噬細(xì)胞內(nèi)原有的物質(zhì)；2吞噬體吞噬有害物質(zhì)；3.通過(guò)內(nèi)吞作用提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。吞噬作用也是細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)的一種方式， 細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用將一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包進(jìn)內(nèi)吞體，在溶酶體酶的作用下，將吞進(jìn)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化，用于合成代謝。
圖3.溶酶體吞噬作用
溶酶體疾病及檢測(cè)手段
溶酶體的酶發(fā)生變異，導(dǎo)致底物在溶酶體中大量堆積，影響細(xì)胞功能異常引起的疾病稱(chēng)為溶酶體病。溶酶體與許多疾病的發(fā)生有著極為密切的關(guān)系，例如炎癥、矽肺、尤其是先天性溶酶體缺陷等疾病都與溶酶體機(jī)能異常有關(guān)。溶酶體異常還與休克、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腫瘤等疾病發(fā)生有關(guān)聯(lián)。
目前檢測(cè)溶酶體異常的手段有很多，包括光鏡鑒定法、電鏡鑒定法、.細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法等等，這些方法可以直接檢測(cè)到溶酶體外形結(jié)構(gòu)、通透性、pH變化等等。目前人類(lèi)也開(kāi)發(fā)了一系列溶酶體檢測(cè)試劑盒，包括細(xì)胞膜通透性（LAP）完成性吖啶橙染色試劑、LAMP抗體及二抗，還包括溶酶體探針類(lèi)染料，LysoTracker探針和LysoSensor探針。LysoTracker探針和LysoSensor探針可以選擇性地標(biāo)記和追蹤活細(xì)胞酸性細(xì)胞器。
Yeasen生物提供多款不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的溶酶體探針如：綠色、紅色、黃色熒光基團(tuán)等等，滿(mǎn)足您多標(biāo)實(shí)驗(yàn)的不同需求。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
LysoTracker探針
LysoTracker探針，由熒光基團(tuán)連接到一個(gè)弱堿性基團(tuán)組成，其中僅弱堿基團(tuán)可部分提供質(zhì)子，以維持pH在中性值。這使LysoTracker探針可自由無(wú)阻地穿過(guò)細(xì)胞膜，特征性的聚集在球形細(xì)胞器，對(duì)酸性細(xì)胞器有高選擇性，用于活細(xì)胞溶酶體特異性熒光染色。機(jī)制尚不明確，可能涉及細(xì)胞器膜上的質(zhì)子化和滯留，一般后面處理細(xì)胞的弱堿性滲透劑不會(huì)逆轉(zhuǎn)染色效果。LysoTracker熒光可能在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)熒光中占很小部分，因此很難通過(guò)流式或熒光計(jì)定量溶酶體數(shù)量。
LysoSensor探針
LysoSensor探針是細(xì)胞內(nèi)的pH熒光指示劑，可通過(guò)質(zhì)子化作用聚集在酸性細(xì)胞器內(nèi)。這個(gè)質(zhì)子化也減弱染料的熒光淬滅性，從而增加熒光強(qiáng)度。因此，與LysoTracker系列探針相比，LysoSensor系列探針隨著細(xì)胞器的酸化程度增強(qiáng)，其熒光強(qiáng)度呈極大的pH依賴(lài)型(向酸)增強(qiáng)。
產(chǎn)品選擇指南
注：探針標(biāo)記細(xì)胞后，只能用熒光顯微鏡觀(guān)察，而不能用流式或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，因?yàn)樵诳偧?xì)胞熒光中溶酶體熒光只占非常小的比例。
產(chǎn)品特點(diǎn)
特異性強(qiáng)：高選擇性地識(shí)別和標(biāo)記靶向酸性細(xì)胞器，幾乎不對(duì)線(xiàn)粒體染色；
種類(lèi)齊全：多種熒光顏色可供選擇、可與其他熒光染料或蛋白同時(shí)使用進(jìn)行多色分析；
簡(jiǎn)單方便：自由滲透細(xì)胞膜，一步法染色、標(biāo)記活細(xì)胞細(xì)胞器--溶酶體，染料可快速導(dǎo)入；
靈敏度高：納摩爾濃度水平標(biāo)記活細(xì)胞的效果較高。
染色結(jié)果
圖5A.4T1細(xì)胞染色結(jié)果圖。綠色是FITC標(biāo)記細(xì)胞，紅色是LysoTracker Red DND-99 染色溶酶體。
參考文獻(xiàn)：Di L, Yang A , Simin F , et al. Imidazole-Bearing Polymeric Micelles for Enhanced Cellular Uptake, Rapid Endosomal Escape, and On-demand Cargo Release[J]. AAPS PharmSciTech, 2018. 19(6), 2610–2619.
圖5B. Hela細(xì)胞染色結(jié)果圖。(a) Lyso-Tracker Red DND-99染色Hela細(xì)胞；(b) Lysosensor Green DND-189染色Hela細(xì)胞
參考文獻(xiàn)：Zhang L, Chen X,, et al. Palladium nanoparticles induce autophagy and autophagic flux blockade in Hela cells. RSC Advances, 2018,8(8), 4130–4141.
FAQ
問(wèn)題類(lèi)別 | 問(wèn) | 答 |
實(shí)驗(yàn) 咨詢(xún) | 1.四種溶酶體探針的區(qū)別？ | LysoTracker®--不依賴(lài)pH的活細(xì)胞溶酶體熒光探針（貨號(hào)40738和40739）； LysoSensor™--依賴(lài)pH的活細(xì)胞溶酶體熒光探針（貨號(hào)40767和40768）。 |
2.LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO探針原理？ | LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO)是一種pH依賴(lài)型顯示雙激發(fā)和雙發(fā)射波長(zhǎng)的熒光探針：
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3.染色時(shí)，細(xì)胞的狀態(tài)？ | 這四種探針是對(duì)活細(xì)胞中的酸性區(qū)室進(jìn)行染色。所以必須要在活細(xì)胞狀態(tài)下染色。 | |
4.染色完成后，細(xì)胞是否能固定后再檢測(cè)熒光信號(hào)？ | 固定后會(huì)破壞溶酶體的酸性環(huán)境從而會(huì)造成熒光減弱甚至消失的情況，染色前后均不建議固定。 | |
5.可以和二抗一起孵育嗎？ | 不可以，孵育二抗必須要透化處理，而透化會(huì)破壞溶酶體的酸性環(huán)境，影響染色效果。 | |
6.這個(gè)探針可以染自噬溶酶體嗎 | 自噬溶酶體和正常的溶酶體在形態(tài)結(jié)構(gòu)上有較大差異，該探針主要是針對(duì)常規(guī)的溶酶體染色，對(duì)于自噬溶酶體的染色效果不是很確定，可以參考一些使用過(guò)該產(chǎn)品發(fā)表的文獻(xiàn)資料確定。 | |
7.植物細(xì)胞和組織適用嗎？ | 理論上可以，一般植物細(xì)胞或者組織要制成原生質(zhì)體。 | |
8.可以染色其他酸性細(xì)胞器嗎？ | 可以染色其他酸性細(xì)胞器，建議極低濃度下才能優(yōu)先選擇染色酸性溶酶體。 | |
9.染色后可以放置一夜，再熒光檢測(cè)嗎？ | 建議染色完立即檢測(cè)熒光，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，熒光信號(hào)會(huì)逐漸減弱。 | |
10.用細(xì)胞培養(yǎng)基配成工作液以后穩(wěn)定嗎？可以存放多久？ | 工作液是需要現(xiàn)配現(xiàn)用的，不建議保存。 | |
11.檢測(cè)儀器？ | 熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀。 | |
12.如何做到同時(shí)染色溶酶體和細(xì)胞核的？ | 建議用Hoechst 33258/ Hoechst 33342染色細(xì)胞核，這個(gè)染料可以直接染活細(xì)胞不需要固定操作。 | |
13.保質(zhì)期多久？ | -20℃避光保存，半年有效。 | |
實(shí)驗(yàn) 問(wèn)題 | 14.熒光信號(hào)較弱？ | 大致有3個(gè)原因： 1.溶酶體探針濃度過(guò)低，建議適當(dāng)增大濃度； 2.染色時(shí)間過(guò)短，建議延長(zhǎng)染色時(shí)間； 3.染色完之后，放置過(guò)長(zhǎng)時(shí)間才檢測(cè)信號(hào)；建議染色完立刻檢測(cè)。 |
15．沒(méi)有熒光信號(hào)？ | 大致有3個(gè)原因： 1.先用多聚甲醛、乙醛等固定細(xì)胞，破壞了溶酶體的酸性環(huán)境。 2.染色完后，又用多聚甲醛固定細(xì)胞，或者透化細(xì)胞，破壞了溶酶體的酸性環(huán)境；染色前后均不建議固定細(xì)胞； 3.染色完到上機(jī)檢測(cè)這一段時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，并且沒(méi)有避光處理。建議避光染色，染色完立即檢測(cè)熒光信號(hào)。 | |
16.在活細(xì)胞狀態(tài)下，用50 µM探針染色50 min，然后發(fā)現(xiàn)除了溶酶體，細(xì)胞質(zhì)中也有熒光信號(hào)，這主要是什么原因?qū)е拢?/span> | 大致有一下3個(gè)原因： |
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格（¥） |
LysoTracker Green DND-26 溶酶體綠色熒光探針 | 40738ES50 | 50μL | 425.00 |
LysoTracker Red DND-99 溶酶體紅色熒光探針 | 40739ES50 | 50μL | 425.00 |
LysoSensor™ Green DND-189 溶酶體綠色熒光探針 | 40767ES50 | 300T | 1533.00 |
LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160 (PDMPO) 溶酶體黃/藍(lán)色熒光探針 | 40768ES50 | 50μL | 425.00 |
