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磁珠深度解析，真的非AMPure XP不可嗎？
引文：
基因測序越來越得到臨床的認可，尤其是精準醫(yī)療概念提出以后，更是備受青睞，為精準治療解答很多未知的問題。高通量測序技術的跨越式發(fā)展，使測序能力大幅上升，在整個NGS工作流程中，磁珠是*的產(chǎn)品。磁珠通過磁顆粒活性基團在一定條件下可與核酸結合和解離的原理，將樣本中目的片段分離。可實現(xiàn)對核酸樣本的高通量自動化操作，廣泛應用于基因測序以及分子診斷領域。
一、磁珠簡述
1. 背景介紹
磁珠的發(fā)明構想初來自于挪威科技大學的化學家John Ugelstad 。后期經(jīng)過不斷地創(chuàng)造與改善，目前我們zui常見的磁珠是納米級別的磁珠，這類磁珠各式各樣，根據(jù)其表面性質的不同，分離的原理也不盡相同，但其材料組成和基本的結構并無太大的差異。基礎結構分為三層，內層的是聚苯乙烯，第二層包裹磁性物質Fe3O4，外層是修飾的官能團（如羧基）。其中官能團能與核酸結合，表面基團不同，下游的應用也不盡相同，如核酸提取，純化，生物素捕獲等。
圖1. 磁珠結構示意圖
2. 原理解讀
商業(yè)化磁珠產(chǎn)品體系一般包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、鹽離子等。在整個體系中，影響DNA回收的因素包括聚乙二醇（PEG）、DNA大小和濃度、孵育時間等，其中PEG是影響DNA回收的決定性因素。DNA在較高濃度的PEG和NaCl中脫去分子水化層，分子構象由線狀被壓縮成卷曲球狀，并暴露出大量帶負電荷的磷酸基團，帶負電荷的磷酸基團與羧基在Na+的作用下形成“電橋"，使DNA被特異吸附到磁珠表面。當PEG和NaCl被去除之后，加入水性分子，會快速充分水化DNA，解除三者間的離子作用，使得吸附到磁珠的DNA被純化出來。 此外，不同長度的DNA隨PEG分子量、濃度以及鹽濃度的不同，可以被選擇性的沉淀出來。
圖2. 磁珠吸附DNA原理示意圖
二、磁珠應用
磁珠憑借其高通量，適用于自動化的特點在高通量測序中備受推崇，并廣泛用于NGS建庫中DNA的提取、純化和分選。
1. 核酸提取
磁珠法提取中的細胞裂解液是一種蛋白變性劑，可使動植物的細胞裂解，并使與核酸結合的蛋白質變性。核酸被游離釋放，攜帶正電荷的磁珠易于吸附負電荷的核酸，核酸與磁珠結合后，經(jīng)過數(shù)次洗滌與磁場捕獲，去除DNA/RNA以外的蛋白質、多糖等雜質，再用洗脫液解離吸附在磁珠上的DNA/RNA，洗脫下來的核酸即可通過PCR 或其它特定方法來檢測特定的DNA 或RNA。磁分離法也是廣泛應用于診斷行業(yè)，且能實現(xiàn)高通量、自動化的核酸提取方法。
圖3. 磁珠核酸提取流程示意圖
2. DNA純化
DNA純化的目的在于去除不想要的DNA段。由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，因而可通過一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丟棄上清中的非目標片段，之后將磁珠吸附的目的DNA洗脫回收。常用于小片段如接頭二聚體/引物二聚體的去除。此外還有一些客戶會用于樣本的富集。
圖4. DNA純化流程示意圖
DNA樣本經(jīng)磁珠純化后會有部分樣本的損失，磁珠回收效率可評估磁珠的回收能力。通?？赏ㄟ^計算得出：回收效率=（純化后的DNA質量/Input DNA質量）×100%。如下圖數(shù)據(jù)所示：翊圣DNA磁珠批次間穩(wěn)定性佳，回收效率與XP磁珠相當，可作為一款高性價比產(chǎn)品替換XP磁珠。
表1. 磁珠回收效率計算
平行 | 樣本 | Input（ng） | 純化（1.8×） | ||
純化后（ng） | 回收率% | 平均回收率 | |||
平行1 | A-XP | 169.5 | 153.25 | 90.41% | 90.41% |
B-YS | 159.75 | 94.25% | 94.5% | ||
C-YS | 162 | 95.58% | |||
D-YS | 158.75 | 93.66% | |||
平行2 | A-XP | 156 | 92.04% | 92.04% | |
B-YS | 156.5 | 92.33% | 93.51% | ||
C-YS | 160 | 94.4% | |||
D-YS | 159 | 93.81% | |||
【注】：磁珠測試數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司，表格中A為AMPure XP磁珠；B、C、D分別是翊圣磁珠三個不同批次。
3. DNA雙輪分選（片篩）
由于二代測序段短讀長的局限性，所以終的NGS文庫需滿足一定的長度要求。片篩的目的在于從片段化DNA中選擇特定區(qū)域的DNA段，以滿足上機需求。比如將樣本中的片段分布比作下圖中的正態(tài)分布，由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，所以第—輪磁珠吸附目的片段以上的大片段，此時棄磁珠留上清（目的片段在上清中）。第二輪磁珠吸附目的片段，此時棄上清，再將磁珠上的目的片段洗脫回收。
圖5. DNA雙輪分選流程示意圖
分選精度則是評估不同的磁珠投入比例分選得到的片段大小。一般以Agilent 2100儀器檢測。
在特定磁珠比例條件下，不同樣本分選后片段分布范圍集中在同一位置。較好的分選效果應該是頂部窄而圓潤的獨峰。此外不同廠家由于buffer的不同在特定磁珠比例條件下分布也會有一定的差異，使用前需根據(jù)各廠家相應的說明書確認目標片段的分選比例。如下數(shù)據(jù)所示：相同的分選比例，翊圣磁珠與進口XP磁珠，分選效果高度一致。
表2. 分選效率計算
樣本 | 測試人 | 分選（0.65×/0.2×） | 測試人 | 分選（0.65×/0.2×） | ||||||
Input（ng） | 分選后（ng） | 回收效率% | 平均回收率 | Input（ng） | 分選后（ng） | 回收效率% | 平均回收率 | |||
A-XP | 測試人1 | 276.44 | 55.2 | 19.97% | 19.97% | 測試人2 | 276.44 | 48.9 | 17.69% | 17.69% |
B-YS | ||||||||||
61.35 | 22.19% | 22.84% | 60.15 | 21.76% | 21.31% | |||||
C-YS | 65.4 | 23.68% | 60.15 | 21.76% | ||||||
D-YS | 62.55 | 22.63% | 56.4 | 20.4% | ||||||
【注】：磁珠測試數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司，表格中A為AMPure XP磁珠；B、C、D分別是翊圣磁珠三個不同批次。
三、產(chǎn)品信息
Hieff NGS® DNA Selection Beads基于SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization)原理，配合精心優(yōu)化過的緩沖體系，可用于二代測序文庫構建過程中的DNA段分選、純化。本產(chǎn)品可適用于各品牌的DNA、RNA建庫試劑盒，和目前廣泛使用的XP 磁珠使用方式相同，片段回收效率和文庫大小分布均與 XP 磁珠高度吻合。但翊圣磁珠的可以做到3元/庫，與進口XP磁珠達到3倍之差！
表3. 2020翊圣磁珠價格
翊圣磁珠 | 規(guī)格 | 價格/元 |
Hieff NGS® DNA selection Beads | 450ml/瓶 | 26186 |
*/元（即日至4月30日） | ||
1~5瓶，13500/瓶 | ||
6~10瓶，12000/瓶 | ||
11~20瓶，9800/瓶 | ||
21~50瓶，8000/瓶 | ||
51~100瓶，7000/瓶 | ||
>100瓶，另議 | ||
