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細胞轉(zhuǎn)染是指將外源DNA或RNA導入目標細胞中的過程。這一過程可以通過多種方法實現(xiàn)，包括化學法轉(zhuǎn)染、物理法轉(zhuǎn)染、生物法轉(zhuǎn)染等。細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在生命科學研究中具有廣泛的應(yīng)用，例如基因表達研究、功能研究、基因治療和藥物開發(fā)等。通過轉(zhuǎn)染，可以實現(xiàn)基因編輯、蛋白質(zhì)表達、信號傳導研究等，為揭示細胞機制、開發(fā)新藥和治療疾病提供了重要工具。
真核生物的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細胞核中，蛋白質(zhì)合成發(fā)生在細胞質(zhì)中。因此，一個真核信使RNA必須從細胞核中被運出來才能被翻譯成多肽。而原核細胞沒有細胞核，所以它們的轉(zhuǎn)錄和翻譯都在細胞質(zhì)中進行。
圖1.真核&原核細胞轉(zhuǎn)錄和RNA加工流程[1]
細胞轉(zhuǎn)染主要分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：
是指將外源DNA導入細胞中，目的基因能夠入核，并整合到宿主細胞基因組中，通過藥物加壓篩選，只保留成功轉(zhuǎn)染的陽性細胞，使其在細胞分裂和傳代過程中持續(xù)穩(wěn)定地存在和表達。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA能夠遺傳給后代細胞，從而實現(xiàn)長期的基因表達。
瞬時轉(zhuǎn)染是指將外源DNA或RNA導入細胞中，使其在一段有限的時間內(nèi)進行高效表達，但是不能隨細胞傳代而持續(xù)穩(wěn)定表達。瞬時轉(zhuǎn)染通常使用化學轉(zhuǎn)染試劑或物理方法（如電穿孔、微注射等）導入外源DNA，并使其在短暫的時間內(nèi)表達所需的蛋白質(zhì)。
常用轉(zhuǎn)染方法及應(yīng)用
目前轉(zhuǎn)染方法主要包括物理方法、化學方法及生物方法，轉(zhuǎn)染方法的選擇取決于細胞類型以及研究目的，即使相同的細胞，不同的轉(zhuǎn)染試劑之間也有較大差異，所以在使用新細胞系時，系統(tǒng)評估轉(zhuǎn)染條件至關(guān)重要[2,3]。
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圖2.細胞轉(zhuǎn)染示意圖[4]
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染有何異同
相同點：針對質(zhì)粒DNA，不論是瞬時轉(zhuǎn)染還是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，都可以通過物理法（電轉(zhuǎn)、顯微注射、基因槍），化學法（陽離子脂質(zhì)體，陽離子聚合物、磷酸鈣），生物法（病毒介導）進行轉(zhuǎn)染；并且轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié)的操作基本一致。
差異點：穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建所用質(zhì)粒，一定是包含抗性基因，便于后續(xù)加壓篩選；瞬轉(zhuǎn)所用的質(zhì)粒可以包含抗性基因也可以不包含抗性基因。
瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常見誤區(qū)
誤區(qū)一
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因會整合到染色體，瞬時轉(zhuǎn)染不會
首先我們要了解基因從DNA到蛋白質(zhì)的過程：DNA被轉(zhuǎn)運至細胞后會入核，DNA在細胞核內(nèi)，根據(jù)堿基互補配對原則，和基因的選擇性表達等，轉(zhuǎn)錄出mRNA；mRNA通過核孔來到細胞質(zhì)中的核糖體上，通過高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等加工，在空間上通過折疊，反轉(zhuǎn)，螺旋等方式形成空間結(jié)構(gòu)。從而形成具有生物活性的蛋白質(zhì)。一般會分為胞內(nèi)表達、分泌型、單次跨膜及多次跨膜不同形態(tài)。
所以不管是瞬轉(zhuǎn)還是穩(wěn)轉(zhuǎn)，DNA都會入核并有一定概率隨機整合到宿主染色體；的區(qū)別在于，穩(wěn)轉(zhuǎn)所用的質(zhì)粒含有抗性基因，后期是通過藥物篩選，把沒有轉(zhuǎn)進目的基因的細胞殺死，保留下來的就是成功轉(zhuǎn)入目的基因的細胞，所以通過一定時間的藥物篩選，保存下來的細胞都是能夠穩(wěn)定遺傳的細胞，稱之為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；而瞬時轉(zhuǎn)染由于沒有藥物加壓篩選，加上僅有少量的細胞中有目的基因整合到染色體，所以在傳代的過程中，陽性細胞會越來越少，導致表達量逐漸降低，進而不能長期穩(wěn)定表達。
圖3.蛋白表達模式圖[5]
誤區(qū)二
只有慢病毒感染才能構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株
能夠用來做瞬轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)染方法，都可以用來做穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建，比如電轉(zhuǎn)、化學試劑轉(zhuǎn)染、慢病毒感染等，只不過三種轉(zhuǎn)染方法在具體的應(yīng)用上會有一定差異；需要注意的是RNA轉(zhuǎn)染，由于RNA不需要入核，所以針對RNA轉(zhuǎn)染一般只是做瞬轉(zhuǎn)表達。
誤區(qū)三
構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株費時費力，周期長，不確定性高，常規(guī)實驗室不方便構(gòu)建
1、細胞株構(gòu)建需要通過藥物加壓篩選，與瞬轉(zhuǎn)相比周期長，但在進行科學研究時，確定了一個長期研究的靶標，后續(xù)都會針對某一基因進行相關(guān)實驗，那么這個時候構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株就顯得尤為必要，畢竟細胞株相較于瞬轉(zhuǎn)來說，最大的優(yōu)點就是表達穩(wěn)定性高，批間差異小，實驗結(jié)果可靠性更高。
2、有的細胞轉(zhuǎn)染效率比較低，通過瞬轉(zhuǎn)的方式，很難獲得足夠的陽性細胞進行實驗，通過構(gòu)建細胞株，就可以提高陽性率，獲得足量穩(wěn)定過表達的細胞株。
3、有的人可能會覺得構(gòu)建細胞株周期太久，結(jié)果不可控；其實，在我們構(gòu)建細胞株時，通常會在轉(zhuǎn)染后48h進行表達量檢測以及初步的功能驗證，這個時候我們就可以知道是否轉(zhuǎn)染成功，就可以知道細胞株構(gòu)建是否會成功；至于操作難度，這里也可以給大家分享實驗protocol（具體操作如下）。
穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建操作流程：
1、重組質(zhì)粒構(gòu)建：按照實驗室的需求，將目的基因構(gòu)建到含有抗性基因的載體中（如pLVX-puro），進行無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提，獲得目的質(zhì)粒，最終拿到的質(zhì)粒，濃度最好不低于1000 ng/μL，濃度過低會影響轉(zhuǎn)染效率。
2、細胞準備：在轉(zhuǎn)染前一天傳代細胞，保證在第二天能夠有70%左右的匯合度（具體情況可根據(jù)細胞而定）。
3、細胞轉(zhuǎn)染：按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進行細胞轉(zhuǎn)染即可。
4、細胞檢測：轉(zhuǎn)染后48h，取部分細胞進行表達量或功能檢測，初步判斷是否轉(zhuǎn)染成功，若失敗，查找失敗原因；若成功，則進行后續(xù)實驗。
5、細胞鋪板：細胞計數(shù)后，按照10/100/1000個細胞每孔鋪板96孔板（鋪板數(shù)量可以梯度測試），鋪板培養(yǎng)基需要含有篩選藥物；不建議直接在原細胞中直接加入藥物進行篩選，這樣會降低細胞存活率。
6、克隆挑選：細胞鋪板后14天，顯微鏡觀察克隆生長情況，并將陽性克隆移至12孔板繼續(xù)培養(yǎng)（根據(jù)細胞量轉(zhuǎn)移到合適的細胞培養(yǎng)板即可）。
7、克隆檢測：按照實驗室檢測方法進行表達量或功能驗證，篩選出若干個優(yōu)選克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，待細胞大量擴培后，可再進行一次復檢。
8、細胞建庫：按照實驗需求進行細胞建庫，如果需要構(gòu)建單克隆細胞株，可以在優(yōu)選克隆基礎(chǔ)上按照單個細胞每孔進行二輪篩選。
細胞轉(zhuǎn)染常見FAQ
問
質(zhì)粒：首先要確保我們序列的準確性，其次是質(zhì)粒的高純度；質(zhì)粒濃度最好不低于1000 ng/uL（該濃度只是建議濃度，低濃度也可以成功轉(zhuǎn)染，只不過轉(zhuǎn)染效率會有所降低）。
細胞類型：要保證是一個健康狀態(tài)的細胞；不同細胞類型對轉(zhuǎn)染方法和試劑的敏感性不同，因此轉(zhuǎn)染效率也會有差異。
轉(zhuǎn)染方法：按照轉(zhuǎn)染試劑說明書要求進行轉(zhuǎn)染條件摸索，確定最佳轉(zhuǎn)染條件。
問
如果瞬轉(zhuǎn)效率比較低，這時會推薦構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，可以通過藥物加壓篩選，獲得穩(wěn)定過表達的細胞株，提高陽性率，解決轉(zhuǎn)染效率低的問題。
問
目前主要有物理方式，化學試劑及病毒等轉(zhuǎn)染方式；通常物理轉(zhuǎn)染需要昂貴的儀器及復雜的轉(zhuǎn)染參數(shù)，一般實驗室無法滿足；化學試劑是目前比較通用的一種方法，因其價格便宜，操做簡單，被廣泛使用，不過該類產(chǎn)品一般只能轉(zhuǎn)染比較常規(guī)的細胞，針對個性化腫瘤細胞其轉(zhuǎn)染效率會下降，所以針對較難轉(zhuǎn)染的細胞，主要是通過慢病毒進行轉(zhuǎn)染；當然，如果細胞本身就是那種非常難轉(zhuǎn)染的，慢病毒也不一定會有很高的轉(zhuǎn)染效率。
問
不需要，質(zhì)粒線性化和未線性化均可，親測兩種差異不大。
問
報告基因細胞株構(gòu)建流程和上述細胞株構(gòu)建方法基本一致，首先需要確定所用報告基因質(zhì)粒是正確（涉及到具體的信號通路），根據(jù)細胞類型，選用適合的轉(zhuǎn)染方法，按照質(zhì)粒載體上標注的抗性基因進行藥物篩選即可。（翌圣生物提供上百種報告基因質(zhì)粒產(chǎn)品可供選擇）
相關(guān)產(chǎn)品
針對細胞轉(zhuǎn)染，翌圣可以提供多款轉(zhuǎn)染試劑，能夠匹配更多應(yīng)用場景，如常規(guī)DNA轉(zhuǎn)染、siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染及病毒包裝轉(zhuǎn)染試劑等，其中PEI轉(zhuǎn)染試劑能夠提供GMP級別產(chǎn)品，支持項目申報。
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 應(yīng)用 |
Hieff Trans® Liposomal Transfection Reagent 脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑 | 40802ES | 轉(zhuǎn)染DNA，文章高引用產(chǎn)品 |
Hieff Trans®siRNA/miRNA體外轉(zhuǎn)染試劑 | 40806ES | 轉(zhuǎn)染siRNA/miRNA |
Calcium Phosphate Cell Transfection Kit 磷酸鈣法細胞轉(zhuǎn)染試劑 | 40803ES | 轉(zhuǎn)染DNA，效率高，成本低 |
Polyethylenimine Linear (PEI) MW40000（rapid lysis） 線性PEI轉(zhuǎn)染試劑（速溶型）MW40000 | 40816ES | PEI轉(zhuǎn)染試劑（粉末） |
Hieff Trans® PEI轉(zhuǎn)染試劑 | 40820ES | PEI轉(zhuǎn)染試劑（科研級） |
Hieff Trans® PEI Transfection Reagent-GMP | 40821ES | PEI轉(zhuǎn)染試劑（GMP級） |
參考文獻
[2] Hamm A, Krott N, Breibach I, Blindt R, Bosserhoff AK. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 2002 Apr;8(2):235-45. doi: 10.1089/107632702753725003. PMID: 12031113.
[3] Badakov R, Ja?wińska A. Efficient transfection of primary zebrafish fibroblasts by nucleofection. Cytotechnology. 2006 Jun;51(2):105-10. doi: 10.1007/s10616-006-9018-3. Epub 2006 Sep 21. PMID: 19002901; PMCID: PMC3449684.
[4] Guo X, Ma Y, Wang H, Yin H, Shi X, Chen Y, Gao G, Sun L, Wang J, Wang Y, Fan D. Status and developmental trends in recombinant collagen preparation technology. Regen Biomater. 2023 Nov 29;11:rbad106. doi: 10.1093/rb/rbad106. PMID: 38173768; PMCID: PMC10761200.
[5] Ahmad M, Hirz M, Pichler H, Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Jun;98(12):5301-17. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5. Epub 2014 Apr 18. PMID: 24743983; PMCID: PMC4047484.
