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在合理區(qū)間內(nèi)，Ct值小，感覺美滋滋，但Ct值大的時候，可能就難受了≧ ﹏ ≦
今天小翌就給大家分享一下如何應(yīng)對Ct值偏大的問題~
Ct值，即循環(huán)閾值（Cycle Threshold），是指熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中熒光信號超過背景噪音水平時的循環(huán)次數(shù)，是最重要的關(guān)鍵參數(shù)，可用于分析基因表達(dá)差異、計(jì)算基因拷貝數(shù)或者實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制等等。
從圖表上我們可以看到的是熒光閾值和擴(kuò)增曲線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)即為Ct值。其中出現(xiàn)的熒光閾值一般是基線的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，在實(shí)際操作中也可以手動調(diào)節(jié)。
而Ct值與模板量、產(chǎn)物量之間的關(guān)系為：
擴(kuò)增產(chǎn)物量Xn=起始模板量X0×（1+擴(kuò)增效率En）循環(huán)個數(shù)n
其中En表示的是擴(kuò)增效率。當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物量增長到一定量級后，所發(fā)出的熒光信號等于熒光閾值，此時的循環(huán)個數(shù)則為Ct值。由計(jì)算方式可以了解到，Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物量為定值時，起始模板量越大，Ct值越小；起始模板量越小，Ct值越大。
但是小伙伴們要注意，Ct值不是恒定不變的，不同的樣本、不同的儀器會對該數(shù)據(jù)有一定的影響，有時即使是相同的樣品在相同的儀器上重復(fù)2-3遍，Ct值也會存在差異。
Ct值的范圍通常在15-35之間。當(dāng)Ct值小于15，則認(rèn)為在基線期擴(kuò)增范圍內(nèi)，未達(dá)到熒光閾值。當(dāng)Ct值大于35時，不適宜用于定量，僅能做定性判斷。但是有不少小伙伴表示，Ct值在30以上心里就很難受了，數(shù)據(jù)使起來不痛快，為什么會出現(xiàn)大的Ct值呢？
上文中有提到關(guān)系等式：
擴(kuò)增產(chǎn)物量Xn=起始模板量X0×（1+擴(kuò)增效率En）循環(huán)個數(shù)n
可以發(fā)現(xiàn)要達(dá)到一定的擴(kuò)增產(chǎn)物量，Ct值同起始模板量和擴(kuò)增效率En有一定的關(guān)系。
不同的小伙伴對于起始模板的投入量有不同的選擇，例如選擇將cDNA原液稀釋10倍后作為反應(yīng)模板上機(jī)檢測；直接選擇cDNA原液作為反應(yīng)模板上機(jī)檢測；又或者在進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時選用100ng RNA或1000ng RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
不同的反應(yīng)模板量會對Ct值造成影響，模板量越多，Ct值越小,而模板量越少，Ct值就越大。10倍的模板量差異，對應(yīng)的Ct值差異約在3.3個循環(huán)數(shù)(23.33=10)。
理論情況下，模板量投入越多，Ct值會變得越小，但實(shí)際操作時要注意！小伙伴們在閱讀反轉(zhuǎn)錄試劑或者熒光定量試劑說明書時，會發(fā)現(xiàn)模板投入量都會存在上限。例如反轉(zhuǎn)錄時模板RNA投入量不建議超過2000ng，熒光定量PCR時投入的cDNA原液體積不能超過總反應(yīng)體系的1/10。切記不要盲目為了減少Ct值無限制地增加模板投入量。模板本身除了包含核酸外，還有其他潛在的上游反應(yīng)殘留物或抑制物，量大時會對下游反應(yīng)造成一定的抑制作用。
理論情況下，PCR擴(kuò)增將1個DNA分子變成2個DNA分子，擴(kuò)增效率為100%。但實(shí)際情況下，由于PCR反應(yīng)中存在抑制因素，導(dǎo)致擴(kuò)增效率低于100%，而一些污染、非特異擴(kuò)增或者引物二聚體會導(dǎo)致擴(kuò)增效率高于100%。
通常建議選用擴(kuò)增效率在90%-110%之間的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試?？吹竭@，小伙伴會問，我如何知道我的反應(yīng)體系擴(kuò)增效率在多少？
通常獲取真實(shí)的擴(kuò)增效率需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲取曲線斜率，從而換算出擴(kuò)增效率。
標(biāo)準(zhǔn)曲線制作案例：以染料法熒光定量檢測A基因
盡量準(zhǔn)備高濃度的待測cDNA或質(zhì)粒DNA，于室溫中瞬離混勻備用。根據(jù)個人需求按照一定梯度稀釋核酸樣本，一般建議6-8個梯度。
每個梯度做3個技術(shù)重復(fù)，配制大體系平均分配至小體系準(zhǔn)確定會更高。期間也要注意混勻，槍頭的替換和氣泡排除等操作細(xì)節(jié)。
上機(jī)后，熒光定量PCR儀器會根據(jù)輸入的信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖和換算。
觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率是否落在-3.58~-3.10之間以及相關(guān)系數(shù)R2是否≥0.98。(斜率折算成擴(kuò)增效率的算法：擴(kuò)增效率=10(-1/斜率)-1)
選用擴(kuò)增效率在90%-110%之間的反應(yīng)體系，當(dāng)然，越接近100%越好。當(dāng)擴(kuò)增效率下降5%時，對應(yīng)的Ct值大約會增加1。當(dāng)擴(kuò)增效率較低，在80%以下時，Ct值會明顯偏大。
首先，小伙伴們，當(dāng)Ct值偏大，尤其在30以上時，切記先不要慌，先保存好辛苦做出來的數(shù)據(jù)，冷靜下來后細(xì)心分析下數(shù)據(jù)，看看數(shù)據(jù)本身是否合理且可使用！若復(fù)孔Ct值的STD＜0.2且熔解曲線單峰，則表明該數(shù)據(jù)是可靠的，可用于數(shù)據(jù)分析。
當(dāng)Ct值大于30且復(fù)孔STD值＞0.2時，若其本身為低表達(dá)基因且在其他研究或發(fā)表文獻(xiàn)中都得到驗(yàn)證，可嘗試將技術(shù)重復(fù)從3管提升至5-6管。再次上機(jī)后，剔除其中差異較大的技術(shù)重復(fù)，選用STD值最小的復(fù)孔數(shù)據(jù)。
目標(biāo)模板濃度偏低
a. 通過增加反轉(zhuǎn)錄時RNA的投入量從而提高模板濃度，或減少cDNA模板稀釋度，理論上每稀釋10倍，Ct值增大3.3。
b. 模板降解的風(fēng)險(xiǎn)，選用新鮮的RNA或分裝保存好的未開封RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取新的cDNA。選擇高產(chǎn)高穩(wěn)的RNA提取試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑。
c. 若基因本身表達(dá)豐度就很低，嘗試選用高靈敏的qPCR試劑來進(jìn)行熒光定量PCR。
擴(kuò)增片段過長
a.擴(kuò)增產(chǎn)品片段不要過長，選擇產(chǎn)物長度在80-300bp之間的。
b.可嘗試標(biāo)準(zhǔn)的三步法擴(kuò)增提高長片段的擴(kuò)增效率。但是要注意片段長度很長的，該方法效果不大，建議選用方法a。
擴(kuò)增效率異常，嚴(yán)重偏離100%±10%
a. 做好引物設(shè)計(jì)，避免二級結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)和錯配，減少非特異擴(kuò)增。
b. 確保RNA純度達(dá)標(biāo)(OD260/280、OD260/230)，減少抑制物對于反應(yīng)的影響。
c. 若原采用cDNA原液作為模板，可嘗試對cDNA原液進(jìn)行一定比例稀釋后進(jìn)行分析。
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