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N6-甲基腺苷（m6A）是高等真核生物信使RNA（mRNA）內(nèi)部豐富的修飾，與人類的發(fā)育，免疫，腫瘤生成和轉(zhuǎn)移，干細(xì)胞更新，脂肪分化等過程息息相關(guān)，目前m6A甲基化修飾已成為科研中一個(gè)重要且熱門的研究方向，因此，開發(fā)m6A甲基化的檢測方法也尤為重要。
甲基化RNA免疫共沉淀高通量測序(MeRIP-seq/m6A-seq)是目前研究m6A甲基化修飾使用廣泛的技術(shù)之一。該技術(shù)利用特異性識(shí)別m6A甲基化修飾的抗體，對(duì)細(xì)胞內(nèi)具有m6A甲基化修飾的RNA片段進(jìn)行免疫共沉淀。然后，對(duì)沉淀下來的RNA片段進(jìn)行高通量測序，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，以在全基因組范圍內(nèi)系統(tǒng)研究m6A甲基化修飾的情況。盡管MeRIP-seq是一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)，但因其受到輸入量、抗體特異性、交聯(lián)效率、非定量讀數(shù)等因素影響，MeRIP-seq很難實(shí)現(xiàn)對(duì)m6A甲基化修飾全轉(zhuǎn)錄組無偏好檢測和絕對(duì)定量。
圖1. MeRIP-seq/m6A-seq技術(shù)原理[1]
隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和創(chuàng)新，有一種更加準(zhǔn)確、可靠和高效的m6A甲基化修飾檢測技術(shù)出現(xiàn)了，即E. coli tRNA-specific adenosine deaminases（TadA）酶輔助的m6A測序技術(shù)（eTAM-seq）。
TadA是一種來源于大腸桿菌的腺嘌呤脫氨酶，自然界中野生型TadA可對(duì)單鏈RNA（ssRNA，主要是轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）內(nèi)的環(huán)區(qū)）或雙鏈RNA（dsRNA）的腺嘌呤脫氨，對(duì)DNA無脫氨活性。TadA可以在tRNAArg的單鏈反密碼子環(huán)中將A轉(zhuǎn)化為I，I在DNA的修復(fù)和復(fù)制過程中被讀為G。TadA經(jīng)蛋白改造后重組表達(dá)而來的突變體，也可以用于ssDNA的腺嘌呤高效脫氨。
圖2. TadA作用原理圖
eTAM-seq
在《Nature Biotechnology》雜志上，芝加哥大學(xué)化學(xué)系的湯瑋欣教授、陳夢潔教授和何川教授共同發(fā)表了一篇名為“Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination"的文章。該研究報(bào)道了一種基于TadA酶輔助的m6A測序技術(shù)（eTAM-seq），利用了TadA酶的特性，能夠以單堿基分辨率對(duì)m6A進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。相較于傳統(tǒng)方法，該方法能有效保持RNA樣本完整性，另外僅需要極少量的RNA樣本，便能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)m6A甲基化修飾的精確檢測和定量分析，為表觀轉(zhuǎn)錄組破譯提供了新方法。
圖3. eTAM-seq測序原理[2]
eTAM-seq測序原理與實(shí)驗(yàn)流程
eTAM-seq技術(shù)通過對(duì)未被甲基化修飾的A進(jìn)行脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化成I，I能與C配對(duì)，在經(jīng)過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)后變?yōu)镚，而甲基化修飾的m6A保留了其甲基化狀態(tài)，仍被檢測為A，從而識(shí)別出轉(zhuǎn)錄組中的m6A修飾。具體實(shí)驗(yàn)流程如下：
poly A尾去除
將RNA與oligo-dT進(jìn)行退火處理，使用RNase H特異性消化RNA的poly A尾。
RNA打斷、末修及3’接頭連接
對(duì)RNA進(jìn)行片斷化處理，隨后使用T4 PNK進(jìn)行末端修復(fù)，最后利用T4 RNA ligase 2在RNA3’端連接接頭。
TadA脫氨處理
未被甲基化修飾的A進(jìn)行脫氨反應(yīng)轉(zhuǎn)化成I，甲基化的A保持不變。
cDNA合成及5’接頭連接
將脫氨酶處理后的RNA與RT引物退火，利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，隨后利用T4 RNA ligase 1在cDNA的5’端連接接頭。
PCR擴(kuò)增及測序
圖4. eTAM-seq實(shí)驗(yàn)流程[2]
eTAM-seq技術(shù)的高準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性以及單堿基分辨率等特性，使其在進(jìn)一步優(yōu)化并推廣至單細(xì)胞水平的檢測中具有巨大的潛力。但eTAM-seq的核心原料TadA目前無商業(yè)化產(chǎn)品，限制了其應(yīng)用，翌圣緊跟科研前沿，借助翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor（點(diǎn)擊了解更多）酶改造及發(fā)酵、純化工藝平臺(tái)成功開發(fā)了TadA脫氨酶（Cat#14556ES），并可提供eTAM-seq的相關(guān)酶原料，助力新技術(shù)研發(fā)及轉(zhuǎn)化。經(jīng)過多家頂尖工業(yè)與科研機(jī)構(gòu)客戶驗(yàn)證，本產(chǎn)品在eTAM-seq應(yīng)用中展現(xiàn)出的性能表現(xiàn)。
eTAM-seq技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品
流程 | 產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
Poly A去除 | RNase H | RNase H | 12906ES |
末端修復(fù) | T4 PNK | T4 Polynucleotide kinase | 12902ES |
脫氨 | TadA脫氨酶 | E.coli tRNA adenosine deaminase (ecTadA) | 14556ES |
逆轉(zhuǎn)錄 | 逆轉(zhuǎn)錄酶 | Hifair® Ultra Reverse Transcriptase | 14604ES |
RNase抑制劑 | UCF.ME® High Affinity RNase Inhibitor | 14675ES | |
接頭連接 | RNA連接酶 | T4 RNA Ligase 1 | 14651ES |
PCR擴(kuò)增 | 高保真擴(kuò)增酶 | Hieff Canace®II High-Fidelity DNA Polymerase | 10140ES |
參考文獻(xiàn)
[1] Tang J, Chen S, Jia G. Detection, regulation, and functions of RNA N6-methyladenosine modification in plants. Plant Commun. 2023;4(3):100546.
[2] Xiao YL, Liu S, Ge R, et al. Transcriptome-wide profiling and quantification of N6-methyladenosine by enzyme-assisted adenosine deamination. Nat Biotechnol. 2023;41(7):993-1003.
