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背 景
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells"的縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導的殺傷細胞"。CIK細胞來源于CD3+CD56-T細胞, 是激活的Ⅱ型T淋巴細胞且同時兼具NK細胞的殺傷特性。但CIK細胞在外周血中含量甚微(約1%-5%)。因此要將CIK細胞用于臨床治療, 首先必須進行大量擴增。CIK細胞的產(chǎn)生過程大致如下：利用密度梯度離心法將患者或健康人外周血中單核細胞分離出來后, 通過添加外源性細胞因子如IFN-γ、IL-2、IL-1、CD3單抗進行體外誘導擴增。體外擴增2周-4周后, 培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量具有強抗癌活性的異質(zhì)細胞群, 即為CIK細胞。CIK細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點。該細胞對腫瘤細胞的辨認能力非常強，好像 “ 細胞 " ，能 “ 點射 " 腫瘤細胞，但不會傷及 “ 無辜 " 的正常細胞。因而，CIK 細胞治療是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。
圖1.CIK細胞制備流程[1]
CIK培養(yǎng)用細胞因子和抗體
白細胞介素-2 (IL-2 )
IL-2是引起T細胞增殖最重要的細胞因子。IL-2通過其受體共用鏈IL-2Rβ鏈和γ鏈, 經(jīng)Jak/Stat信號轉(zhuǎn)導通路參與細胞增殖, 同時促進NK細胞和T細胞定向分化為效應細胞發(fā)揮殺傷作用。
干擾素-gama (IFN-γ )
FN-γ對提高細胞毒活性非常重要, 不同的添加順序與細胞毒活性密切相關。將IFN-γ添加在IL-2之前可以明顯提高細胞毒活性, 其機制在于IFN-γ可以誘導外周血淋巴細胞表面IL-2受體(IL-2R)的高表，從而會增強T細胞對IL-2促增殖反應的敏感度和強度。
白細胞介素-1a（IL-1a）
IL-1a也可以提高外周血淋巴細胞表面IL-2R的表達。當IL-1a與IFN-g和激發(fā)型CD3單抗合用時，可以明顯提高CIK 的細胞毒作用。
CD3激發(fā)型單抗
T細胞活化的第一信號來自于T細胞表面的受體，即T細胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC提呈的抗原的特異性結合，也就是T細胞對抗原的特異性識別。CD3分子在T細胞活化信號的轉(zhuǎn)導中起著極其關鍵的作用。CD3激發(fā)型單抗與T細胞表面CD3分子特異性結合后，可引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進而導致T細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T細胞增殖和活化。也就是說，CD3激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復合物的識別和激活過程，從而引起T細胞的增殖與活化，因此是CIK細胞培養(yǎng)中的刺激因素。
此外，CD3激發(fā)型單抗需要注意克隆號?？寺√枮镺KT3的CD3激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T細胞的增殖，而其它克隆號的CD3激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的T細胞。因此，在進行CIK培養(yǎng)時，最好選用OKT3克隆。
細胞制備
外周血單個核細胞的采集
用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞50-100mL；
淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。
CIK細胞的培養(yǎng)
將PBMC按1-2 x 106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000 U/ml 的重組人IFN-g，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
24h后加入50ng/ml的CD3 單克隆抗體和300 U/ml 的重組人IL-2，刺激CIK 細胞的生長和增殖；此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1a；
每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK細胞。
CIK細胞質(zhì)控
臺盼藍染色檢測：活細胞應在80%以上；
流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3+CD56+細胞的比例應在20%以上；
細胞殺傷實驗：以CIK細胞為效應細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為靶細胞，將效應細胞與靶細胞按10 : 1(數(shù)目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶細胞1 x 104個，終體積為200 ml，設3個復孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測效應細胞對靶細胞的殺傷率。
收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素。
推薦試劑
應用 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
CIK細胞培養(yǎng) | Human IL-2 | 90103ES | 10μg/100μg |
Human IFN-gama | 91207ES | 20μg/50μg/100μg | |
Human IL-1α | 90100ES | 2μg/10μg/50μg | |
CIK細胞質(zhì)控 | 臺盼藍染色法細胞活力檢測試劑盒 | 40208ES | 100T/500T |
內(nèi)毒素檢測試劑盒 | 60401ES06 | 17T | |
一步法快速支原體檢測試劑盒 | 40612ES | 25T/100T | |
乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒 | 40209ES76 | 500 T |
參考文獻
[1] Jingting Jiang, Changping Wu &Binfeng Lu .Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity[J]. Journal of Translational Medicine volume 11, Article number: 83 (2013) .
