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支原體概念和污染的影響
支原體（Mycoplasma）又稱(chēng)霉形體，是目前發(fā)現(xiàn)的最小、無(wú)細(xì)胞壁的原核生物，直徑大小0.1~0.3μm，能通過(guò)濾膜且呈高度多形性，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中相對(duì)常見(jiàn)且難以檢測(cè)的細(xì)菌污染物。
支原體污染對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成多方面的不良影響，已經(jīng)成為在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，保守估計(jì)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染率為15~35%，嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。
細(xì)胞培養(yǎng)中95%的支原體污染主要是由萊氏無(wú)膽甾原體、精氨酸支原體、口腔支原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、豬鼻支原體引起的。支原體在培養(yǎng)基上，形成的菌落呈“煎雞蛋“形狀。細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞膜適宜支原體生長(zhǎng)，寄生在細(xì)胞表面的支原體可以穿透宿主細(xì)胞膜。
支原體污染來(lái)源主要有：細(xì)胞培養(yǎng)液或其成分（如培養(yǎng)基原料、血清和其他試劑）、實(shí)驗(yàn)室操作人員、細(xì)胞培養(yǎng)箱、液氮培養(yǎng)箱、空氣中的粒子和氣溶膠、抗生素的過(guò)度使用、密封不當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)物和污染了支原體的細(xì)胞等。
與此同時(shí)，這些污染對(duì)應(yīng)的危害為：導(dǎo)致細(xì)胞制品或以細(xì)胞為介質(zhì)進(jìn)行生產(chǎn)的產(chǎn)品在下游純化過(guò)程中可能因未能有效去除支原體而造成批次報(bào)廢、污染其接觸的所有相關(guān)設(shè)備設(shè)施甚至中間或終產(chǎn)品、導(dǎo)致其他正常細(xì)胞受到支原體污染、導(dǎo)致重要細(xì)胞或病毒種子庫(kù)受到支原體污染而報(bào)廢、導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室整體環(huán)境受到污染而被迫停止生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)操作進(jìn)行支原體去除、導(dǎo)致支原體產(chǎn)生耐受性而更難以去除、支原體污染面積擴(kuò)大、對(duì)實(shí)驗(yàn)室中的其他細(xì)胞培養(yǎng)物造成威脅。
因此，定期進(jìn)行支原體檢測(cè)和去除，確保無(wú)支原體存在細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)才能保障科學(xué)研究工作的正常進(jìn)行。
支原體檢測(cè)
支原體是一種比較常見(jiàn)但通常難以去除的污染類(lèi)型，對(duì)于涉及細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品工藝過(guò)程，法規(guī)要求“必須確保無(wú)支原體污染"。
2020年版中國(guó)藥典三部《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制》中提出對(duì)于生產(chǎn)用細(xì)胞，需要對(duì)主細(xì)胞庫(kù)（MCB）、工作細(xì)胞庫(kù)（WCB）、生產(chǎn)終末細(xì)胞（EOPC）進(jìn)行支原體檢查。
FDA, Guidance for Industry:Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，提出對(duì)于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進(jìn)行支原體控制。
ICH Q5D《用于生產(chǎn)生物技術(shù)/生物產(chǎn)品的細(xì)胞底物的起源和特征描述》也提到：對(duì)于原材料、病毒種子、未加工的收獲液等都需要進(jìn)行支原體控制。
圖1.中外法規(guī)里要求的支原體污染檢測(cè)點(diǎn)
傳統(tǒng)的支原體檢測(cè)方法主要為培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法，但由于這兩種方法的檢測(cè)周期長(zhǎng)或靈敏度問(wèn)題，致使企業(yè)生產(chǎn)或產(chǎn)品放行周期拉長(zhǎng)。而隨著細(xì)胞基因治療的發(fā)展，行業(yè)內(nèi)對(duì)支原體檢測(cè)時(shí)效性和靈敏度要求越來(lái)越高，短的貨架期不足以支撐如此長(zhǎng)的檢測(cè)周期，因此快檢的NAT方法從眾多支原體檢測(cè)方法中脫穎而出。
圖2.中外法規(guī)里列舉的支原體檢測(cè)方法
基于NAT (nucleic acid amplification techniques)核酸擴(kuò)增技術(shù)，翌圣生物開(kāi)發(fā)了一系列支原體快速檢測(cè)的試劑盒，其中包括熒光探針qPCR法支原體檢測(cè)試劑盒、一步恒溫顯色法支原體檢測(cè)試劑盒和巢式PCR法支原體檢測(cè)試劑盒。
熒光探針qPCR法支原體檢測(cè)試劑盒
是一種快速定性檢測(cè)生產(chǎn)原料、細(xì)胞庫(kù)、病毒種子、病毒或細(xì)胞收獲液、治療用細(xì)胞中潛在支原體污染的產(chǎn)品，即主要用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的藥物研發(fā)、生產(chǎn)、放行等方面。
產(chǎn)品資質(zhì)
符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗(yàn)證，符合國(guó)際機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)；
配合審計(jì)：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)，有完善的審計(jì)文件；
保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn)，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定；
技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀，Kit靈敏度可達(dá)10CFU/mL及以下；
專(zhuān)注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫(kù)，雙封閉抗體提高了Kit特異性、靈敏度、穩(wěn)定性。
產(chǎn)品特點(diǎn)
檢測(cè)種類(lèi)多：優(yōu)化的TaqMan探針可檢測(cè)多達(dá)183種支原體；
操作簡(jiǎn)便：樣本制備和檢測(cè)總時(shí)長(zhǎng)<3h，無(wú)需培養(yǎng)法的28天等待；
靈敏度高：檢測(cè)限達(dá)到可以替代直接培養(yǎng)法的10CFU/mL；
專(zhuān)屬性強(qiáng)：針對(duì)16s rRNA設(shè)計(jì)引物探針，不與梭菌、乳桿菌等親緣關(guān)系物種交叉反應(yīng)；
安全性高：試劑盒內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照(PC)無(wú)感染性，消除污染風(fēng)險(xiǎn)；
防干擾強(qiáng)：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC)，可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等因素，有效避免假陰性。
圖3.熒光探針qPCR法支原體檢測(cè)工作流程
一步恒溫顯色法支原體檢測(cè)試劑盒
采用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在顏色判別方面具有更強(qiáng)的辨識(shí)度，由藍(lán)紫色（陰性）向天藍(lán)色（陽(yáng)性）變，更利于肉眼的判別，增加了防污染組分，杜絕假陽(yáng)性現(xiàn)象的存在。
圖4. 一步恒溫顯色法支原體檢測(cè)操作流程
巢式PCR法支原體檢測(cè)試劑盒
不同于普通的一步法PCR檢測(cè)方法，將原先的1對(duì)引物提高至3對(duì)引物，針對(duì)支原體16s和23s保守區(qū)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，在改變產(chǎn)品非特異性的同時(shí)大大提升了產(chǎn)品的靈敏度，可以檢測(cè)低至單個(gè)拷貝的支原體。
圖5.巢式PC法支原體檢測(cè)操作流程
支原體去除
在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，定期檢測(cè)能夠有效的避免支原體大量污染，但如果細(xì)胞已受支原體污染，則需對(duì)其進(jìn)行及時(shí)處理，最佳處理原則為將細(xì)胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細(xì)胞株。若受污染的細(xì)胞比較珍貴，必須去除支原體污染，可以通過(guò)混合使用抗生素以達(dá)到目的。由于支原體無(wú)細(xì)胞壁，因此傳統(tǒng)的抗生素一般對(duì)其無(wú)效。此時(shí)，選擇一款合適的支原體去除試劑尤為重要。
翌圣生物MycAway™ Treatment (1000×)支原體去除試劑，是一種混合抗生素制劑，含有三種對(duì)支原體具有抑菌作用的組分，分別是喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素衍生物類(lèi)和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。該支原體去除試劑可通過(guò)抑制DNA和支原體生長(zhǎng)所必須的相關(guān)蛋白合成來(lái)取得良好的支原體清除效果，且對(duì)細(xì)胞無(wú)傷害，挽救細(xì)胞，減少因支原體污染帶來(lái)的損失。
產(chǎn)品特點(diǎn)
毒性低：對(duì)細(xì)胞毒性小，不影響后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞轉(zhuǎn)染和活力檢測(cè)等；
穩(wěn)定性強(qiáng)：-20℃試劑能較長(zhǎng)時(shí)間保存并保持高效用；
操作簡(jiǎn)單：只需將產(chǎn)品添加至支原體污染的培養(yǎng)基中孵育即可；
起效快：最快3天即可見(jiàn)效；
去除范圍廣：能去除實(shí)驗(yàn)室絕大多數(shù)支原體類(lèi)型。
圖6.支原體去除試劑細(xì)胞毒性檢測(cè)圖示
支原體預(yù)防
在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體污染常有發(fā)生，但由于其特殊性很難被肉眼和顯微設(shè)備檢測(cè)到，因此做好支原體的預(yù)防工作顯得尤為重要?？赏ㄟ^(guò)向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防試劑，來(lái)有效預(yù)防支原體的污染。
目前實(shí)驗(yàn)室支原體主要來(lái)自于：細(xì)胞間的交叉污染、工作環(huán)境或者實(shí)驗(yàn)器材的污染、實(shí)驗(yàn)者無(wú)菌操作不佳、污染的培養(yǎng)基或者試劑、帶有支原體污染的原始組織或者器官等。翌圣生物開(kāi)發(fā)的支原體預(yù)防系列產(chǎn)品，具有操作簡(jiǎn)單、方便、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，非常適合日常細(xì)胞系培養(yǎng)中支原體預(yù)防。
產(chǎn)品信息
