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測(cè)序數(shù)據(jù)不好？是不是建庫出了問題？
測(cè)序數(shù)據(jù)不好？是不是建庫出了問題？！——從測(cè)序數(shù)據(jù)看文庫構(gòu)建高通量測(cè)序中的文庫構(gòu)建指的是在DNA兩端連接特定的接頭從而使其符合測(cè)序平臺(tái)要求的過程，在高通量測(cè)序過程中，文庫質(zhì)量直接影響終測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，打個(gè)比方，如果文庫上機(jī)測(cè)序的濃度很低，樣本在FlowCell上擴(kuò)增所形成的DNA樣本簇就會(huì)很少，測(cè)序數(shù)據(jù)量也將減少，這就可能導(dǎo)致測(cè)序失敗，所以我們說文庫的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)估也是NGS中的關(guān)鍵步驟。文庫如何質(zhì)控？評(píng)估文庫質(zhì)量的方法有哪些？文庫質(zhì)控：文庫在上機(jī)之前都有會(huì)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，質(zhì)量檢測(cè)合格的文庫才 -
逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)做不好，是不是引物出了問題
實(shí)驗(yàn)室常用到的實(shí)驗(yàn)：逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)人員通過體外模擬病毒復(fù)制過程，以提取的RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄酶催化，合成出與RNA互補(bǔ)的cDNA鏈。終構(gòu)建cDNA文庫，并從中篩選所需的靶標(biāo)基因。BUT！小伙伴們做逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)，1）有沒有深究過RNA逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA能不能真實(shí)反映出基因表達(dá)信息？2）做實(shí)驗(yàn)時(shí)，有沒有發(fā)生過內(nèi)參做的很好，目的基因做不出的情況？如果有發(fā)生上述情況，那么需要重新評(píng)估逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果有效性的評(píng)定逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性的評(píng)定重要的是盡可能反映樣本中原始RNA模板的信息， -
雙判定標(biāo)準(zhǔn)判定qPCR擴(kuò)增特異性，提升Ct值真實(shí)性
qPCR實(shí)驗(yàn)易做，但數(shù)據(jù)分析并非想象中的那么容易！數(shù)據(jù)分析的好與壞，極大程度上依賴于qPCR原始結(jié)果的質(zhì)量。qPCR結(jié)果的評(píng)價(jià)指標(biāo)?溶解曲線，是qPCR結(jié)果判定的第—要素。它的作用是判定目的基因是否得到擴(kuò)增。理論上，當(dāng)反應(yīng)體系中僅是目標(biāo)基因的擴(kuò)增，才是有效擴(kuò)增。?標(biāo)準(zhǔn)曲線，是qPCR結(jié)果判定的金標(biāo)準(zhǔn)。（在溶解曲線判定為特異性擴(kuò)增后）它的作用是測(cè)定引物的擴(kuò)增效率及試劑的檢測(cè)上下限。根據(jù)文章發(fā)表對(duì)于qPCR數(shù)據(jù)的要求，擴(kuò)增效率應(yīng)在90-110%。?擴(kuò)增曲線，是直接生成qPCR定量的數(shù)據(jù)，即Ct值。從 -
qPCR進(jìn)階攻略—帶你玩轉(zhuǎn)儀器設(shè)置
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)是分子實(shí)驗(yàn)室常用的一項(xiàng)技術(shù)。持續(xù)關(guān)注小翊的應(yīng)該都掌握了高質(zhì)量cDNA的獲取方法，引物設(shè)計(jì)指南以及反應(yīng)體系的配制技巧（還未get的小伙伴戳文末鏈接），然而上機(jī)時(shí)，發(fā)現(xiàn)和別人的反應(yīng)條件不一致卻又不敢動(dòng)儀器？本期小翊將帶你玩轉(zhuǎn)qPCR儀器的設(shè)置！目前市面上的qPCR儀器種類五花八門，但基本上儀器的設(shè)置都相對(duì)一致。我們以ABI7500為例進(jìn)行介紹。反應(yīng)板設(shè)置實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇：我們將實(shí)驗(yàn)命名為“Yeasen”，進(jìn)行“Quantitation：ΔΔCt”實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法選擇：如選用SYBRGre -
dsDNAHSAssayKitforQubit®——給我5min，還你一個(gè)準(zhǔn)確定量結(jié)果1產(chǎn)品概述dsDNAAssayKitforQubit®是Yeasen生物開發(fā)的專門用于Qubit®熒光儀或熒光酶標(biāo)儀的試劑盒，線性范圍0.2-100ng，即使在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，也可以選擇性的檢測(cè)dsDNA，且耐受較高濃度的蛋白質(zhì)、鹽類、洗滌劑等污染物。2產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)1）操作簡(jiǎn)便——5min之內(nèi)出結(jié)果2）高選擇性——對(duì)dsDNA具有高度選擇性，不定量RNA和ssDNA。圖dsDNAAssa
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遺傳中心法則表明，DNA是生物體內(nèi)遺傳信息的載體。遺傳信息在精密的調(diào)控下從DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，再傳遞到蛋白質(zhì)。因此RNA被認(rèn)為是DNA與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的“橋梁”，在研究轉(zhuǎn)錄組信息中占有著重大的作用。背景介紹轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）是指在某一特定的生理?xiàng)l件下，細(xì)胞、組織或者生物體內(nèi)所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，即轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA總和，包括編碼RNA（即mRNA）和ncRNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等不同類型的RNA分子。在這之中核糖體RNA(
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RNA文庫建的好，輕松完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析不是夢(mèng)
常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）主要是在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行NGS測(cè)序，這樣可以全面快速地獲取某一物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本，包括mRNA和非編碼RNA。目前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序主流的方法是芯片法和RNA-Seq法。RNA-Seq相較于芯片法優(yōu)勢(shì)明顯，如：不受物種限制通量高靈敏度高分辨率高同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本并準(zhǔn)確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)及SNP、UTR區(qū)域等。此次疫情爆發(fā)，溯源工作主要是依靠這種方法。圖1常規(guī)RNA-Seq建庫流程精品推薦mRNA建庫試劑盒（適用Illumin -
背景介紹熒光素酶生物檢測(cè)技術(shù)誕生于1990年，已有供了更可靠的研究30年的發(fā)展史。單熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)到雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展，為科研人員提供了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)手段。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在原有的基礎(chǔ)上引入了海腎報(bào)告基因，可以排除不同組之間細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。其發(fā)光原理如下圖1。圖1雙熒光素酶發(fā)光原理實(shí)驗(yàn)方案將靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5’啟動(dòng)子區(qū)克隆在Fireflyluciferase基因的上游，或把3’-UTR區(qū)或lncRNA結(jié)
