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產品信息

產品描述

Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit是基于Hieff Clone™快速克隆技術的定點突變系統(tǒng)。使用本試劑盒，目標質粒擴增產物經DpnI消化、Hieff Clone™重組環(huán)化后直接進行轉化即可完成定點突變。該試劑盒由兩個模塊組成：Hieff® II Pfu DNA Polymerase擴增模塊和Hieff Clone®快速克隆模塊。Hieff® II Pfu DNA Polymerase超高的保真度顯著降低了擴增過程中引入新突變的可能性，其長片段擴增能力，廣泛適用于長度小于20 kb的任何質粒擴增。Hieff Clone®快速克隆系統(tǒng)利用高效的同源重組反應替代傳統(tǒng)的退火成環(huán)反應。因此使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進行DNA定點突變時，引物設計更加靈活，且擴增反應不再需要以線性方式進行，極大減少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的*降解。Hieff Clone®技術可以高效完成兩個PCR產物的無縫拼接，因此該試劑盒還能以單次擴增的方式對目標質粒上不連續(xù)的兩個位點同時進行突變。

Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit中的重組酶Exnase經過優(yōu)化，專門針對單堿基、不連續(xù)雙堿基定點突變。此外，如擴增產物特異，其DpnI消化產物可不進行DNA純化而直接用于重組反應。高度優(yōu)化的反應緩沖液、快捷的操作流程以及*的成功率，使得Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit成為DNA定點突變試劑盒。

應用范圍

DNA定點突變

注：如使用本品對質粒進行定點突變，請使用甲基化酶無缺陷的宿主菌 (例如Top    ⑩、DH5α、JM109)擴增原始質粒！

產品組成

運輸與保存方法

冰袋（wet ice）運輸。產品-20℃保存。有效期1年。

單堿基（或連續(xù)多堿基）定點突變實驗方案

實驗流程概覽（圖一）

圖一：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進行單堿基（或連續(xù)多堿基）定點突變實驗流程

1. 引物設計

向質粒引入單堿基或連續(xù)多堿基定點突變，只需設計一對引物將質粒進行反向PCR擴增即可。引物設計基本原則為：正反向擴增引物5’端包含15-21 bp反向互補區(qū)域（GC含量40%-60%為佳），各引物非互補區(qū)域長度至少為15 bp（待突變位點至引物3’端區(qū)域Tm值高于60℃為佳）。所需引入突變可以包含在互補區(qū)域內 (需要兩條引物上均引入點突變)，也可以包含在任一條引物的非互補區(qū)域 (只需在一條引物上引入點突變)，請勿將突變位點置于引物末端。以向pUC18引入單堿基突變?yōu)槔镌O計具體方案如圖二所示。

 圖二：向質粒引入單堿基（或連續(xù)多堿基）定點突變引物設計示意圖

注：計算引物Tm值時，應計算待突變位點至引物3’端這一區(qū)域內的堿基，調整引物長度使這一段Tm值高于60℃，待突變位點至引物5’端區(qū)域內的堿基不應參與計算。

2. 目標質粒擴增

2.1 配制PCR反應體系
反應各組分解凍后請充分搖勻，使用完畢后及時放回-20℃。2×Hieff® II PCR buffer請勿長時間敞口放置。
為了增加擴增特異性，反應體系配制過程請于冰水浴中進行。為了防止Hieff® II Pfu DNA Polymerase的校對活性降解引物，請將聚合酶最后加入反應體系中。

a. 請勿使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。

b. 在質粒能正常擴增的前提下，應盡量減少質粒模板使用量，推薦使用≤1 ng新鮮提取的質粒做模板。

c. 推薦的酶的終濃度為1 U/50 μl反應?？蓪ieff® II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之間進行優(yōu)化，但不要超過2 U/50 μl，尤其當擴增子長度大于5 kb時。

2.2 PCR擴增反應

推薦PCR反應條件：

a. 對于大多數(shù)質粒，變性溫度使用95℃即可。

b. Hieff® II Pfu DNA Polymerase能夠促進模板和引物高效退火。一般來說，退火溫度設置為引物Tm值即可。如果需要，可以建立一個溫度梯度反應去尋找引物模板結合的最適溫度。退火時間太長可能導致擴增產物在膠上呈現(xiàn)彌散狀。

c. 對于大多數(shù)擴增反應，延伸過程可在72℃進行。長的延伸時間有助于提高擴增產量。

d. 為了防止擴增過程中引入非目標突變，強烈建議擴增循環(huán)數(shù)≤35。如果擴增效率良好的話，推薦擴增循環(huán)數(shù)≤30。

反應結束后取少量擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測。如目標質粒正確擴增，則可進行下步實驗。

3. 擴增產物DpnI消化，去除甲基化模板質粒
因上述擴增產物中包含原始模板質粒，為防止其在轉化后形成假陽性轉化子，必須在進行重組環(huán)化之前進行DpnI消化。

推薦反應體系如下：

輕輕吹打混勻后，將上述反應體系置于37℃恒溫反應1～2小時。如產物擴增特異，產物條帶單一，DpnI消化產物無需純化，可直接用于后續(xù)重組反應。如擴增不特異，DpnI消化結束后應膠回收純化目標擴增產物。

4. 重組反應

4.1 配制重組反應體系

正反向擴增引物5’端包含*反向互補的一段序列，因此在Exnase催化下擴增產物5’末端和3’末端可以發(fā)生同源重組，完成擴增產物環(huán)化過程。于冰水浴中，將下列組分依次加到無菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎將液體粘在管壁，請務必通過短暫離心使其沉入管底。體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產生氣泡 (請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。

單點突變重組反應體系最適DNA使用量為0.03 pmol。該摩爾數(shù)對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：

DpnI消化產物最適使用量 = [0.02 × 目標質粒堿基對數(shù)] ng (0.03 pmol)

例如，向長度為5 kb的目標質粒引入單點突變，DpnI消化產物最適使用量應為：0.02 ×5000 = 100 ng。

注：DNA量太多或者太少都將降低環(huán)化效率。請務必通過瓊脂糖電泳預先確認DNA濃度，盡量嚴格按照推薦量配制反應體系。當DpnI消化產物最適使用量計算值不足50 ng或者超過400 ng時，加入50ng或400 ng即可。DpnI消化產物不純化直接用于重組反應時，使用量不應超過反應總體積的1/5，即4μl。

4.2 重組反應

1） 將上述體系置于50℃反應 20 min。

2） 待反應完成后，立即將反應管置于冰水浴中冷卻。

3） 之后，反應產物可直接進行轉化；也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。

5. 反應產物轉化、涂板、克隆鑒定

1） 取10 μl冷卻反應液，加入到100 μl感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。

2） 42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。

3） 加入900 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10min充分復蘇。

4） 37℃，200rpm-250rpm，搖菌45 min。

5） 取100 μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

注: 我們推薦您使用轉化效率>108 cfu/μg的感受態(tài)細胞。如果感受態(tài)轉化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鮮制備的感受態(tài)轉化效率通常在106-107 cfu/μg之間)，請將培養(yǎng)菌液在5,000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養(yǎng)基重懸后全部涂板。

不連續(xù)雙堿基定點突變實驗方案 (兩突變位點相距超過50 bp)

實驗流程概覽（圖三）

  圖三：使用Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit進行不連續(xù)雙堿基定點突變實驗流程

1. 引物設計

向質粒兩個不連續(xù)位點引入不連續(xù)雙堿基定點突變，需要設計兩對引物將質粒分為兩段進行擴增。引物設計基本原則為：在每個待突變位點處設計部分反向互補的擴增引物對。每對正反向引物5’端包含15-21 bp反向互補區(qū)域。所需引入突變可以包含在互補區(qū)域內(需要兩條引物上均引入點突變)，也可以包含在任一條引物的非互補區(qū)域(只需在一條引物上引入點突變)，請勿將突變位點置于引物末端。以向pUC18引入雙堿基突變?yōu)槔?，引物設計具體方案如圖四所示。

圖四：向質粒引入不連續(xù)雙堿基定點突變引物設計示意圖

注：計算引物Tm值時，應計算待突變位點至引物3’端這一區(qū)域內的堿基，調整引物長度使這一段Tm值高于60℃，待突變位點至引物5’端區(qū)域內的堿基不應參與計算。

2. 目標質粒擴增

以待突變位點A、B為界，將質粒分為AB段和BA段。使用Hieff™ II Pfu DNA Polymerase對AB段和BA段分別進行擴增。AB段擴增引物對為：待突變位點A正向擴增引物和待突變位點B反向擴增引物；BA段擴增引物對為：待突變位點B正向擴增引物和待突變位點A反向擴增引物。

2.1 配制PCR反應體系

反應各組分解凍后請充分搖勻，使用完畢后及時放回-20℃。2×Hieff® II PCR buffer請勿長時間敞口放置。為了增加擴增特異性，反應體系配制過程請于冰水浴中進行。為了防止Hieff® II Pfu DNA Polymerase的校對活性降解引物，請將聚合酶最后加入反應體系中。
推薦反應體系如下：

a. 請勿使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。

b. 在各片段能正常擴增的前提下，應盡量減少質粒模板使用量，推薦使用≤1 ng新鮮提取的質粒做模板。

c. 推薦的酶的終濃度為1 U/50 μl反應?？蓪ieff® II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之間進行優(yōu)化，但不要超過2 U/50 μl，尤其當擴增子長度大于5 kb時。

2.2 PCR擴增反應

推薦PCR反應條件：

a. 對于大多數(shù)質粒，變性溫度使用95℃即可。對于超過 15 kb的擴增子，變性溫度降低至92℃可以提高擴增效率。

b. Hieff® II Pfu DNA Polymerase能夠促進模板和引物高效退火。一般來說，退火溫度設置為引物Tm值即可。如果需要，可以建立一個溫度梯度反應去尋找引物模板結合的最適溫度。退火時間太長可能導致擴增產物在膠上呈現(xiàn)彌散狀。

c. 對于大多數(shù)擴增反應，延伸過程可在72℃進行。長的延伸時間有助于提高擴增產量。

d. 為了防止擴增過程中引入非目標突變，強烈建議擴增循環(huán)數(shù)≤35。如果擴增效率良好的話，推薦擴增循環(huán)數(shù)≤30。

反應結束后取少量擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測。如目標質粒正確擴增，則可進行下步實驗。

3. 擴增產物DpnI消化，去除甲基化模板質粒
因上述擴增產物中包含原始模板質粒，為防止其在轉化后形成假陽性轉化子，必須在進行重組環(huán)化之前進行DpnI消化。

推薦反應體系如下：

將上述反應體系置于37℃恒溫反應1～2小時。如產物擴增特異，產物條帶單一，DpnI消化產物無需純化，可直接用于后續(xù)重組反應。如擴增不特異，DpnI消化結束后應膠回收純化目標擴增產物。

4. 重組反應

4.1 配制重組反應體系

AB段和BA段擴增產物末端分別包含*一致的一段序列，因此在Exnase催化下兩擴增產物末端可以分別發(fā)生同源重組，完成環(huán)化過程。于冰水浴中，將下列組分依次加到無菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎將液體粘在管壁，請務必通過短暫離心使其沉入管底。體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產生氣泡 (請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。

不連續(xù)雙點突變重組反應體系最適DNA使用量為：較長片段0.03 pmol，較短片段為0.06 pmol。這些摩爾數(shù)對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：

較長片段DpnI消化產物使用量 = [0.02 × 片段堿基對數(shù)] ng (0.03 pmol)

較短片段DpnI消化產物使用量 = [0.04 × 片段堿基對數(shù)] ng (0.06 pmol)

例如，AB段長度為1 kb，BA段長度為5 kb。則DpnI消化產物最適使用量為：AB段0.04 ×1000 = 40 ng；BA段0.02 × 5000 = 100 ng。

注：DNA量太多或者太少都將降低環(huán)化效率。請務必通過瓊脂糖電泳預先確認DNA濃度，盡量嚴格按照推薦量配制反應體系。當DpnI消化產物最適使用量計算值不足20 ng或者超過200 ng時，加入20ng或200 ng即可。DpnI消化產物不純化直接用于重組反應時，使用量不應超過反應總體積的1/5，即4μl。

4.2 重組反應

1）將上述體系置于50℃反應 20 min。

2） 待反應完成后，立即將反應管置于冰水浴中冷卻。

3） 之后，反應產物可直接進行轉化；也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。

5. 反應產物轉化、涂板、克隆鑒定

1）  取10 μl冷卻反應液，加入到100 μl感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。

2）  42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。

3）  加入900 μl SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10min充分復蘇。

4）  37℃，200rpm-250rpm，搖菌45 min。

5）  取100 μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

注: 我們推薦您使用轉化效率>108 cfu/μg的感受態(tài)細胞。如果感受態(tài)轉化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鮮制備的感受態(tài)轉化效率通常在106-107 cfu/μg之間)，請將培養(yǎng)菌液在5,000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養(yǎng)基重懸后全部涂板。

注意事項

1）引物設計時5’端反向互補區(qū)盡量選擇無重復序列，且GC含量比較均勻的區(qū)域。當這一區(qū)域內GC含量在40%～60%范圍之內時，重組環(huán)化效率將達到最大。如這部分區(qū)域GC含量高于70%或者低于30%，重組環(huán)化效率會受到較大影響。

2）當兩突變位點相距小于50bp時，應將其視為一個突變位點，將兩突變引入同一條/對引物進行實驗。

3）DpnI只能識別甲基化DNA，請務必使用從甲基化酶無缺陷的宿主菌中擴增的質粒作為PCR模板。

4）長期放置、反復凍融會導致模板質粒斷裂、開環(huán)或降解，應使用新鮮制備的質粒作為模板。

5）質粒PCR擴增結果需高度特異，雜帶較多會影響實驗結果。

6）重組反應體系中應盡量避免金屬絡合劑(如EDTA)的帶入。因此，建議將DNA純化產物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常規(guī)膠回收試劑盒中的洗脫液可用pH8.0的ddH2O替代)，請勿使用TE進行DNA保存。

7）冷卻后的重組反應產物應在1h內進行轉化，且轉化前保持在冰水浴中。如需儲存，于-20℃凍存。盡量避免室溫較長時間放置或4℃長期儲存。

8）反應產物的轉化體積不應超過感受態(tài)細胞體積的1/10，否則會降低轉化效率。另外，當轉化的DNA濃度太高時，會抑制轉化反應。將重組反應產物稀釋5倍后取1/5進行轉化。

9）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
10）本產品僅作科研用途！

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