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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級(jí)會(huì)員·12年
10923ES通用型一步法無(wú)縫克隆試劑盒(用于同源重組)
| 參考價(jià) | ￥655 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)
- 10923ES 型號(hào)
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
規(guī)格
| 20T | 655元 | 99 件 可售 |
訪問(wèn)次數(shù)：157更新時(shí)間：2024-10-07 13:44:00
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
|---|
該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，兼容未純化PCR產(chǎn)物、
產(chǎn)品介紹
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重組克隆試劑盒，精心優(yōu)化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了的重組增強(qiáng)因子，用于同源重組可顯著提高重組克隆效率。
該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，兼容未純化PCR產(chǎn)物、直接回收的PCR產(chǎn)物、低濃度的膠回收產(chǎn)物，本產(chǎn)品可重組同源臂GC含量30%-70%的接頭片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對(duì)應(yīng)的一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，在50℃條件下最快僅需5 min即可完成重組反應(yīng)?？寺￡?yáng)性率可達(dá)95%以上。
組分信息
組分編號(hào) | 組分名稱 | 10923ES05 | 10923ES20 | 10923ES50 |
10923-A | 2 × Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix | 50 μL | 200 μL | 500 μL |
10923-B | 500 bp control insert (25 ng/μL) | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
10923-C | pUC 19 control vector, linearized (50 ng/μL) | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
儲(chǔ)存條件
-25~-15℃保存，有效期1年。
簡(jiǎn)版使用說(shuō)明
1.重組反應(yīng)
1)線性化載體和插入片段使用量
Hieff Clone®重組反應(yīng)體系各個(gè)片段及載體插入總濃度為0.02 - 1 pmol。載體與各個(gè)插入片段摩爾比為1:2*。對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式計(jì)算獲得：
pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入堿基對(duì)數(shù) × 650 daltons)
50 ng 5,000 bp的DNA片段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段約為0.15 pmol
*當(dāng)插入片段長(zhǎng)度大于載體時(shí)，最適載體與插入片段使用量的計(jì)算方式應(yīng)互換，即插入片段當(dāng)做載體，載體當(dāng)做插入片段進(jìn)行計(jì)算。線性化載體及插入片段的反應(yīng)終濃度可達(dá)到1 ng/μL。線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化直接使用時(shí)，使用總體積應(yīng)不超過(guò)反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過(guò)4 μL。
簡(jiǎn)便的投入量計(jì)算公式：插入片段投入量=2×插入片段長(zhǎng)度×插入載體投入質(zhì)量/載體長(zhǎng)度
2)重組反應(yīng)體系（可等比擴(kuò)大或縮減反應(yīng)體系，冰上配制，各組分使用前需混勻）
組分 | 重組反應(yīng)體系 |
2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix | 10 μL |
每個(gè)插入片段投入量 | X |
目的載體投入量 | Y |
ddH2O | To 20 μL |
表1 反應(yīng)體系
3)重組反應(yīng)條件
體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
當(dāng)插入1個(gè)片段時(shí)，反應(yīng)條件為50℃，5 min；當(dāng)插入片段數(shù)為2-6個(gè)時(shí)，建議反應(yīng)條件為50℃，10 -50 min（反應(yīng)時(shí)間隨片段數(shù)增多而延長(zhǎng)，如表2所示）。超長(zhǎng)載體片段連接，建議反應(yīng)時(shí)間為40-60 min。
連接片段數(shù) | 重組反應(yīng)時(shí)間 |
2 | 10 min |
3 | 20 min |
4 | 30 min |
5 | 40 min |
6 | 50 min |
表2 反應(yīng)時(shí)間
反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲(chǔ)存于-20℃，待需要時(shí)解凍轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化
提前15分鐘將用到的篩選培養(yǎng)基平板拿到37℃預(yù)熱。
在冰上解凍快速克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）。
取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置5 min。
用200 μL移液槍將上一步的混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上，均勻涂布。
將平板置于37℃培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜培養(yǎng)。若進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養(yǎng)15 h。
克隆鑒定
快捷的方法是菌落PCR。用無(wú)菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。推薦至少使用一條通用測(cè)序引物進(jìn)行菌落PCR，可以避免PCR假陽(yáng)性的產(chǎn)生。后續(xù)也可用于酶切或測(cè)序鑒定。
注意事項(xiàng)
1.需自備的材料：
1)自備樣品：自備好線性化載體和插入片段。
2)自備試劑（僅羅列部分）：
超級(jí)感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α快速化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（Cat#11803ES）。
高保真酶：2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效產(chǎn)品。
菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效產(chǎn)品。
核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效產(chǎn)品。
3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等。
2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。
3. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
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