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產(chǎn)品名稱：NEB E6300S cDNA第一鏈合成試劑盒 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

產(chǎn)品貨號：E6300

產(chǎn)品品牌：NEB (New England Biolabs)

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ProtoScript® cDNA 第一鏈合成試劑盒含兩種經(jīng)優(yōu)化的混合液：M-MuLV 酶混合液和 M-MuLV 反應混合液。M-MuLV 酶混合液含 M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶和小鼠 RNase 抑制劑，M-MuLV 反應混合液含 dNTP 和經(jīng)優(yōu)化的緩沖液。該試劑盒還包含兩種優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄引物和無核酸酶水。錨定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物與 polyA 尾的起始端退火。經(jīng)優(yōu)化的隨機引物混合液能隨機并持續(xù)性地與整個 RNA 模板配對，包括 mRNA 和無 polyA 尾的 RNA。合成的第一鏈 cDNA 產(chǎn)物長度可超過 10 kb

成功合成 cDNA 的要素：

RNA 模板
高純度的完整 RNA 對于靈敏的 RT-PCR 檢測至關(guān)重要。RNA 的 A260/A280 比值應至少 1.7 或更高。

總 RNA 或 mRNA 均可用于反轉(zhuǎn)錄反應。總 RNA 通常足以進行大多數(shù) RT-PCR 分析。不過，如果需要，可以使用 PolyA Spin mRNA 分離試劑盒（NEB #S1560）或 mRNA 磁性分離試劑盒（NEB #S1550）獲得 mRNA。

檢測所需的 RNA 量取決于目標轉(zhuǎn)錄本的豐度。通常推薦使用 1 ng 至 1 μg 的總 RNA 或 0.1-100 ng 的 mRNA。

cDNA 第一鏈合成反應
RNA 和引物在 70℃ 條件下變性 5 分鐘，可以去除阻礙較長 cDNA 合成的二級結(jié)構(gòu)。不過，可以在某些情況下省略此步驟（結(jié)果未發(fā)表）。

推薦在 42℃ 條件下溫育一小時，以獲得最高產(chǎn)量和最大長度。不過，許多靶標用較短的溫育時間即可進行檢測。例如，對于 2 kb cDNA 合成，溫育 5 分鐘就足夠了。

選擇反轉(zhuǎn)錄引物
Oligo d(T) 引物是大多數(shù)實驗的首·選，因為它確保所有 cDNA 拷貝在 mRNA 的 3′ 端終止并產(chǎn)生最長的連續(xù) cDNA。錨定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物與 polyA 尾的起始端退火，從而防止在 polyA 尾的內(nèi)部位點開始退火（1）。不過，如果需要，也可以選擇另外兩種引物。

隨機引物混合液是經(jīng)優(yōu)化的六聚體和 d(T)23VN 引物混合液。該混合液能隨機地與整個 RNA 模板配對，包括 mRNA 和無 polyA 尾的 RNA（例如核糖體 RNA）。隨機引物混合液產(chǎn)生的 cDNA 平均長度較短，可用于檢測多個短 RT-PCR 產(chǎn)物。隨機引物混合液在各種 RNA 模板中均具有良好的性能。

基因特異引物用于 cDNA 合成反應時，cDNA 產(chǎn)物只能用于擴增該轉(zhuǎn)錄本。RNA 起始量較低（低于 10 ng）且只需要一種特定的 cDNA 時，使用這種方法可以獲得良好的結(jié)果。

推薦的引物濃度：
引物：終濃度
OLIGO d(T)23VN：5 μM
隨機引物混合液：6 μM
特異引物：0.1–1 μM

產(chǎn)品名稱：NEB E6300S cDNA第一鏈合成試劑盒 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

產(chǎn)品貨號：E6300

產(chǎn)品品牌：NEB (New England Biolabs)

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相關(guān)產(chǎn)品推薦：

• NEB M0277S RNase Inhibitor, Murine: 用于保護RNA免受降解，提高逆轉(zhuǎn)錄效率。

• NEB N0447S DNA Ladder Mix： 用于電泳分析的標準分子量對照，確保片段大小判斷準確。

• NEB M0314S RNase H： 在cDNA合成后消除RNA，增強后續(xù)反應效果。

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