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果汁中嗜熱嗜酸菌的檢測(cè)方法——膜過(guò)濾法和涂布法
閱讀：2007 發(fā)布時(shí)間：2018-9-30
◆背景
此方法用于分析檢測(cè)果汁成品或原料。此文件細(xì)節(jié)性地描述了嗜熱嗜酸菌（以下縮寫(xiě)為T(mén)AB）的定量檢測(cè)和其確認(rèn)測(cè)試。此文件含有關(guān)于TAB的定義，描述和其他的相關(guān)信息。
◆原理
在濃縮果汁，特定甜味劑和一些飲料中，TAB（脂環(huán)酸芽孢桿菌）主要以孢子的形式存在。這些孢子的活性往往在高溫殺菌，并且有合適的生長(zhǎng)環(huán)境的條件下增長(zhǎng)。TAB不會(huì)在冷飲中生長(zhǎng)。如果環(huán)境允許，TAB會(huì)生成一種名為愈創(chuàng)木酚的化合物。此化合物會(huì)給產(chǎn)品和原料帶來(lái)一種藥的味道?；诖怂幬?，樣品被認(rèn)為是腐壞了。
◆原料和標(biāo)準(zhǔn)品
a．酵母提取物（212759，BD）
b．葡萄糖（215530，BD）
c．可溶性淀粉（217820，BD）
d．瓊脂（214530）
e．愈創(chuàng)木酚測(cè)試套裝
◆儀器設(shè)備
a．水浴鍋
b．培養(yǎng)箱
◆實(shí)驗(yàn)過(guò)程
a．培養(yǎng)基（YSG）配制
i．溶液A：在1L燒杯中稱(chēng)量2g酵母提取物，1g葡萄糖和2g可溶性淀粉。加入500mL去離子水溶解。加入適量1N的鹽酸或硫酸，使pH調(diào)整至3.7±0.1。
ii．溶液B：取一個(gè)新的1L的燒杯。稱(chēng)量15g瓊脂并加入500mL去離子水加熱溶解。
iii．在121°C下蒸汽滅菌15分鐘。
iv．當(dāng)溶液A和B的溫度都降至47±0.2°C時(shí)，在無(wú)菌條件下將溶液A倒入溶液B中混合。
v．在培養(yǎng)皿中倒入15至20mL配置完成的培養(yǎng)基（YSG）并使其凝固。將澆好的培養(yǎng)皿放入冰箱中存放。保質(zhì)期為一個(gè)月。
b．樣品準(zhǔn)備（熱擊）
i．在試管中準(zhǔn)備9mL的無(wú)菌水，在無(wú)菌條件下加入1mL濃縮果汁并混勻。
ii．將試管置于80°C水浴鍋中熱擊。當(dāng)樣品溫度到達(dá)80±0.2°C時(shí)計(jì)時(shí)10分鐘。然后快速降溫至室溫。
iii．如果樣品為單倍果汁，則無(wú)需稀釋。
c．樣品分析方法
i．涂布法（用于不可過(guò)濾的樣品）：
1．向固體YSG培養(yǎng)基中加入1mL熱擊過(guò)的稀釋樣品（單倍果汁無(wú)需稀釋?zhuān)苯尤?mL樣品）。將樣品均勻涂抹在培養(yǎng)基表層。
2．將平板正放于45±2°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一天。
3．一天后倒置平板并繼續(xù)培養(yǎng)4天。
ii．膜過(guò)濾法（用于可過(guò)濾樣品）：
1．在50mL無(wú)菌水中加入熱擊過(guò)的稀釋樣品（單倍果汁無(wú)需稀釋?zhuān)苯尤?0mL樣品加入）。混勻后用0.45µm濾膜過(guò)濾。
2．在無(wú)菌條件下將濾膜轉(zhuǎn)移至固體YSG培養(yǎng)基上。
3．倒置平板，在45±2°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。
d．結(jié)果分析
i．如果樣品中菌落計(jì)數(shù)小于原料標(biāo)準(zhǔn)要求，用愈創(chuàng)木酚測(cè)試套裝進(jìn)一步檢測(cè)會(huì)有無(wú)產(chǎn)生鄰甲氧基苯酚的微生物。如果菌落計(jì)數(shù)大于原料標(biāo)準(zhǔn)要求，則直接認(rèn)定為不合格樣品。
ii．陽(yáng)性平板應(yīng)通過(guò)顯微鏡鏡檢來(lái)確定脂環(huán)酸芽孢桿菌的存在。
iii．每一套測(cè)試樣品需要有控制平板做比對(duì)。包括空氣，陽(yáng)性菌對(duì)比，YSG培養(yǎng)基和樣品所使用的無(wú)菌水。
e．愈創(chuàng)木酚測(cè)試套裝
i．用接種環(huán)取10 µL不含孢子的新鮮菌落，懸浮于含有“Va-YSG 試劑 (2mL)”的試管中（≥1×108cfu/mL）。
ii．在45±1°C下培養(yǎng)3小時(shí)或過(guò)夜。
iii．加入1mL鄰甲氧基苯酚測(cè)試套裝試劑1。
iv．加入20µL鄰甲氧基苯酚測(cè)試套裝試劑2。
v．加入20µL鄰甲氧基苯酚測(cè)試套裝試劑3。
vi．混勻并放置5－10分鐘。
vii．觀察溶液的顏色變化。在10分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。
viii．陽(yáng)性控制：取2mL純凈水和100µL陽(yáng)性控制并混合。重復(fù)步驟iii－vii。
ix．空白：取新的“Va-YSG”試劑并重復(fù)步驟ii－vii。
◆質(zhì)量控制檢測(cè)
a．這項(xiàng)測(cè)試需要含有少量TAB陽(yáng)性菌的可過(guò)濾果汁樣品作為過(guò)程檢查。
b．向10mL離心管中加入1mL陽(yáng)性樣品（濃縮）。加入9mL無(wú)菌水或緩沖劑。
c．80±2°C熱擊10分鐘。
d．取1mL樣品至50mL無(wú)菌水中混合。
e．過(guò)濾并把陽(yáng)性控制儲(chǔ)藏在冷凍（-18°C）條件下。
產(chǎn)品信息鏈接：愈創(chuàng)木酚測(cè)試套裝