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　　本文摘自和光純藥時報Vol.87 （2019年1月號），由FUJIFILM株式會社環(huán)境與品質管理部安全性評估中心山本裕介教授、藤田正晴教授、笠原利彥教授以及勝岡尉浩教授共同執(zhí)筆。

 

◆前言

　　從動物福利的觀點出發(fā)，動物實驗的規(guī)定正在世界范圍內不斷推進。從1993年開始，歐盟開始分階段實施化妝品成分的動物實驗規(guī)定，2013年之后，歐盟各國全面禁銷含有進行過動物實驗的原料的化妝品^[1]。

　　在這樣的背景下，不使用動物的安全性測試（動物試驗替代法）的開發(fā)迫在眉睫，皮膚刺激性、眼睛刺激性、皮膚腐蝕性、皮膚致敏性、光毒性等的動物實驗替代法作為獲認可的方法，被列入經濟合作與發(fā)展組織（OECD）的測試指南（TG）中。2006年，日本修訂并實行動物愛護管理法^[2]，此后，3R原則^※在實驗動物中得到了加強。

　　對此，日本也積極推動動物實驗替代法的開發(fā)，替代眼睛刺激性測試的體外短時暴露試驗^[3]（STE，Short Time Exposure in vitro test method）（OECD TG491）、替代皮膚致敏測試的細胞系活化試驗^[4]（h-CLAT，human Cell Line Activation Test）（OECD TG442E ; ANNEX I）以及IL-8 Luc試驗^[5]（IL-8 Luc assay，Interleukin-8 Reporter Gene Assay）（OECD TG442D ; Appendix IA）都被列入了測試指南中。

　　另外，日本還開始研發(fā)替代法需要用到的材料，使用3D培養(yǎng)皮膚模型的用于替代皮膚刺激性測試的重組人表皮試

驗^[6]（Reconstructed Human Epidermis Test Method，OECD TG439）和使用3D培養(yǎng)角膜模型的用于替代眼睛刺激性測試的重組類似人角膜表皮試驗^[7]（RhCE，Reconstructed Human Cornea-like Epithelium Test Method）（OECD TG492），都采用了Japan Tissue Engineering Co., Ltd.生產的皮膚和角膜模型。

　　除上述化妝品行業(yè)外，歐盟的《化學品的注冊、評估、授權及限制法規(guī)》——REACH法規(guī)在2016年6月也修訂了REACH附錄Ⅶ和Ⅷ，規(guī)定每年生產和進口不超過10噸的物質必須使用動物實驗替代法來作為皮膚腐蝕性、皮膚刺激性、眼睛刺激性和皮膚致敏測試的標準測試法。

　　本文將為大家介紹新開發(fā)的試替代皮膚致敏測試的氨基酸衍生物反應法（ADRA，Amino acid Derivative Reactivity Assay）。

 

◆皮膚致敏的機制與替代法

　　皮膚致敏是一種由皮膚暴露在化學物質下引起的過敏反應。皮膚致敏性會使體內的免疫系統(tǒng)將化學物質記憶為異物，因此，當皮膚再次暴露在化學物質時就會表現(xiàn)出過度的反應，引起紅斑（發(fā)紅）、水腫（腫脹）和水皰（水泡）等癥狀。另外，皮膚致敏性與皮膚刺激性的反應不同，免疫系統(tǒng)的過度反應會導致更嚴重的癥狀。此外，由于反應涉及到免疫系統(tǒng)，所以從皮膚暴露在致敏物質中到癥狀的出現(xiàn)是一個復雜的過程。OECD定義了該過程中的四個關鍵事件：1.蛋白與致敏物質的結合，2.角質細胞的活化，3.樹突狀細胞的活化，4.T細胞的增殖^[8]。

　　目前，使用較為廣泛的in vivo（體內）皮膚致敏測試法就是用小鼠進行的局部淋巴結試驗（LLNA，Local Lymph Node Assay），是以關鍵事件4為基礎的評估法。而動物實驗替代法收錄了6種以除關鍵事件4外的其他三個關鍵事件為基礎的測試法，包括以關鍵事件1為基礎的直接肽反應試驗^[9]（DPRA，Direct Peptide Reactivity Assay）（OECD TG442C），以關鍵事件2為基礎的ARE-Nrf2熒光素酶試驗^[10]（ARE-Nrf2 luciferase test method，KeratinoSens™）（OECD TG442D ; Appendix IA）和ARE-Nrf2 Luciferase LuSens^[11]（OECD TG442D；Appendix IB），還有以關鍵事件3為基礎的h-CLAT^[4], U937皮膚致敏試驗^[12]（U-SENS，U937 Skin Sensitization Test）（OECD TG442E；ANNEXⅡ）和 IL-8 Luc試驗^[13]。

　　致敏物質進入人體后和蛋白結合，形成復合物，被免疫細胞之中的樹突狀細胞吸收后，該復合物被視為抗原（異物）。這種蛋白與致敏物質結合形成復合物的過程就是關鍵事件1，和2015年被收錄于TG的DPRA相同，筆者團隊開發(fā)的ADRA也是一種利用過程來評價反應性的測試法。

 

◆ADRA和DPRA的原理比較

　　蛋白與致敏物質的結合，主要是通過蛋白中的巰基，以及半胱氨酸或賴氨酸的氨基的共價結合來實現(xiàn)的^[13,14]。因此，DPRA使用含有半胱氨酸的肽和含有賴氨酸的肽，通過這兩種肽與待測物質的反應性來評價致敏物質與蛋白的結合性能^[15]。

 

圖1. NAC和NAL的結構式

 

　　相比之下，ADRA運用了在半胱氨酸和賴氨酸兩種氨基酸中引入了帶萘環(huán)的新型氨基酸衍生物，N-（2-（1-Naphthyl）acetyl）-L-cysteine（NAC）和α-N-（2-（1-Naphthyl）acetyl）-L-lysine（NAL）（圖1），通過測試它們與待測待測物質的反應結果來評估致敏物質與蛋白的結合性能^[14,15,16]。

　　測試步驟如下。首先，在96孔板上配制NAC、NAL和待測物質以1:50的摩爾比混合的反應溶液，在25℃中遮光孵育24小時。24小時后加入CF₃COOH（TFA）水溶液終止反應，然后用HPLC檢測待測物質和未反應的NAC、NAL的量，從而算出待測物質的NAC、NAL的反應性（圖2）。DPRA和ADRA一樣，在肽與測試物質反應24小時后，用HPLC定量未反應的肽，以計算待測物質的反應性。

 

圖2. ADRA測試法的流程

 

　　與使用培養(yǎng)細胞或生物來源成分的體外（in vitro）測試不同，ADRA 和 DPRA只評價物質的化學反應（in chemico測試），是一種重復性好、精,確度高的簡易測試法。

　　盡管基本原理和測試程序相同，但ADRA用NAC和NAL來替代了肽，所以ADRA在許多方面都優(yōu)于DPRA。

 

表1. ADRA與DPRA的比較表

			ADRA		DPRA
試劑	親核試劑	種類	NAC	NAL	含有半胱氨酸的肽	含有賴氨酸的肽
		在反應溶液中的濃度	5 µM		500 µM
		抗氧化劑	0.2 µM EDTA	無需添加	無	無需添加
	待測物質溶液	溶劑的種類	①水，②乙腈，③丙酮，④DMSO/乙腈		①乙腈，②水，③乙腈/水，④異丙醇，⑤丙酮，⑥丙酮/乙腈，⑦乙腈/ DMSO
		在反應溶液中的濃度	0.25 mM		5 mM	25 mM
	緩沖液	種類	磷酸緩沖液		磷酸緩沖液	醋酸銨緩沖液
		pH	8.0	10.2	7.5	10.2
反應	反應容器		96孔板		HPLC用瓶
	親核試劑所需量		約0.3 µg/孔		約400 µg/瓶
	待測物質所需量 （分子量按200計算）		0.01 mg/孔		0.2 mg/瓶	1 mg/瓶
	反應液總量		200 µL		1000 µL
	溫度		25 ℃
	時間		24小時
終止反應	終止液	溶液	TFA溶液		無
		添加量	50 µL
HPLC檢測	檢測波長		281 nm		220 nm
	分析時間		20分鐘/試劑		20分鐘/試劑

EDTA：乙二胺四乙酸

TFA溶液：2.5%（v/v）CF₃COOH水溶液

 

　　在DPRA中，反應溶液中待測物質的濃度高達5~20 mM，待測物質經常會出現(xiàn)沉淀的現(xiàn)象，并且需要在220 nm短波長下定量這兩種肽，因此會出現(xiàn)與待測物質來源的峰重疊的情況（共出峰），從而無法正確地評估致敏性。

　　另一方面，由于NAC和NAL具都有萘環(huán)，所以它們可以在281 nm處定量，比DPRA長約60 nm。所以幾乎不與待測物質來源的峰共出峰。另外，NAC和NAL在HPLC中的檢測靈敏度高，反應溶液中待測物質可以在0.2 mM的濃度（濃度為DPRA的1/100）下進行測試，基本上不會析出待測物質。

　　除此之外，DPRA中含半胱氨酸的肽的氧化和二聚化會降低定量的準確度，但作者發(fā)現(xiàn)，金屬離子會參與巰基的氧化，所以在ADRA中向NAC的反應溶液加入極微量的EDTA，能改善NAC的穩(wěn)定性^[17]。

　　DPRA中含半胱氨酸肽的二聚體在反應溶液中的析出可能會影響HPLC的檢測，而且不能對它的二聚化進行定量。而在ADRA中，可以通過HPLC定量而不會析出NAC二聚體，即使NAC發(fā)生氧化，也能容易判斷出對測試系統(tǒng)的影響。

　　除了上述要點之外，ADRA還能在HPLC的檢測過程中添加終止液來抑制反應的進行，獲得比DPRA誤差更少且更穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，與在HPLC瓶中配制反應溶液的DPRA不同，ADRA使用96孔板和多通道移液器，可實現(xiàn)高通量，是一種通用性好、操作性*的高精,確度測試法。

 

◆ADRA的致敏評估能力

　　動物實驗替代法需要進行與動物實驗相同的安全性評估。為了確認ADRA和動物實驗一樣能對化學物質進行皮膚致敏評估，作者用建立DPRA測試法時使用過的82種物質對LLNA進行預測準確度評估。結果顯示ADRA的預測準確度高達87%^[18]。

　　綜上，ADRA是一種非常有效的測試法，自2016年以來，作者一直致力于將ADRA收錄在OECD測試指南中。2017年，四所研究機構參與了評估ADRA重復性與有效性的驗證實驗，而該實驗在相同儀器與不同儀器間也獲得了非常高的可重復性。目前，作者正根據(jù)此結果申請將ADRA收錄于測試指南中。

 

◆今后的展望

　　如本文所述，ADRA在很多方面都優(yōu)于DPRA，與其他體外替代法相比，無需使用培養(yǎng)細胞的ADRA還具有眾多優(yōu)點，如無需使用特殊設施、設備及無菌操作等技術，測試周期短、價格低、重復性良好等。

　　歐盟禁止化妝品原料進行動物實驗后，化妝品行業(yè)對動物實驗替代法的需求不斷提高；另外，在REACH法規(guī)修訂后，動物實驗替代法也被納入到除化妝品原料外的一般化學品的安全性評估中。今后，ADRA有望在化妝品行業(yè)以外等更廣泛的領域中得到進一步應用。

 

◆關鍵詞

3R原則

指"Replacement：替換為不使用動物的方法"、""Reduction：減少動物數(shù)量的使用"和"Refinement：減輕實驗對動物帶來的痛苦"的3點動物實驗原則。

 

◆參考文獻

[1]	EU化粧品指令 (第7次改正) European Commission : "DIRECTIVE 2003/15/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 27 February 2003，amending Council Directive 76/768/EEC on the approximation of the laws of the Member States relating to cosmetic products", Official J. European Union, L66/26 (2003).
[2]	環(huán)境省告示，「動物の愛護及び管理に関する施策を総合的に推進するための基本的な指針」，平成 25 年 8 月30日，第 80 號 (2013).
[3]	OECD : "Short Time Exposure In Vitro Test Method for Identifying I） Chemicals Inducing Serious Eye Damage and II）Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 491 (2018).
[4]	OECD : "ANNEX Ⅰ : In Vitro Skin Sensitisation : Human Cell Line Activation Test (h-CLAT)", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018).
[5]	OECD : "ANNEX Ⅲ : In Vitro Skin Sensitisation : IL-8 Luc assay", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018).
[6]	OECD : "In Vitro Skin Irritation : Reconstructed Human Epidermis Test Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 439 (2013).
[7]	OECD : "Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 492 (2018).
[8]	OECD : OECD Series on Testing and Assessment, 168, 1 (2014).
[9]	OECD : "In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA)", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442C (2015).
[10]	OECD : "Appendix IA : In Vitro Skin Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase KeratinoSens™ Test Method", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442D (2018).
[11]	OECD : "Appendix IB : In Vitro Skin Sensitisation : The ARE-Nrf2 Luciferase LuSens Test Method",OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442D (2018).
[12]	OECD : "ANNEX Ⅱ : In Vitro Skin Sensitisation : U937 Cell Line Activation Test （U-SENS™）", OECD Guideline for the Testing of Chemicals 442E (2018).
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