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詳細(xì)介紹
GenomONE ®
仙臺(tái)病毒包膜細(xì)胞融合試劑
GenomONE®-CF EX含有仙臺(tái)病毒包膜和緩沖液，可促使細(xì)胞融合。適用于貼壁或者懸浮狀態(tài)的任何細(xì)胞。僅僅需要30分鐘就可完成融合細(xì)胞及制造混合動(dòng)力的操作。
◆用途
●腫瘤疫苗·癌癥免疫研究
●癌細(xì)胞和樹突細(xì)胞融合等
●再生醫(yī)療·細(xì)胞治療研究
●臟器來源細(xì)胞和干細(xì)胞融合等
●單克隆抗體的制備
●抗原B細(xì)胞和髓過氧化物酶細(xì)胞融合
●分生·分化·育種研究
●對(duì)脫核未受精卵的核移植（核置換）
●其他
●PEG&電融合的使用介紹
◆HVJ Envelope（HVJ-E）：
HVJ包膜是*滅活和純化仙臺(tái)病毒（HVJ*），即只留下細(xì)胞膜融合能力的衣殼蛋白包膜。仙臺(tái)病毒的HN蛋白可與細(xì)胞膜外的唾液酸受體結(jié)合，通過F蛋白的作用，引起細(xì)胞膜融合。在HVJ-E中，仙臺(tái)病毒的基因組RNA已經(jīng)*失活，在人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)不存在感染或增殖。因而不需要特殊的操作和設(shè)備，它可以安全地在普通的實(shí)驗(yàn)室使用。
*HVJ：日本仙臺(tái)病毒
◆HVJ-E細(xì)胞融合原理
在低溫（0 - 8℃)條件下，每一個(gè)細(xì)胞與數(shù)百個(gè)以上的HVJ - E接觸，HVJ - E與細(xì)胞膜上的唾液酸受體結(jié)合，通過細(xì)胞表面吸附（步驟1），細(xì)胞通過HVJ-E相互連接（步驟2），形成細(xì)胞彼此聚集的狀態(tài)。當(dāng)該細(xì)胞/ HVJ-E的復(fù)合物加熱到37℃時(shí)，細(xì)胞膜干擾就會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大，細(xì)胞膜內(nèi)膜結(jié)構(gòu)也暫時(shí)改變。這種變化是短暫的，隨后會(huì)立即返回到正常結(jié)構(gòu)，但是在這個(gè)期間，細(xì)胞膜利用強(qiáng)疏水性結(jié)合力進(jìn)行相互融合（步驟3）。
步驟一 | 步驟二 | 步驟三 |
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◆應(yīng)用方法
懸浮法 | 電鍍法 |
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◆懸浮細(xì)胞融合案例
同種細(xì)胞融合
異種細(xì)胞融合
熒光標(biāo)記的紅（* 1）細(xì)胞和綠色熒光標(biāo)記（* 2）細(xì)胞（每1.0×105個(gè)）在融合緩沖液50 μL混合后，加入HVJ-E冰敷5分鐘，隨后37℃下反應(yīng)15分鐘后，融合細(xì)胞（黃色）進(jìn)行了觀察。
◆黏著態(tài)和懸浮態(tài)細(xì)胞融合案例
在粘合狀態(tài)BHK-21（紅）和在浮動(dòng)狀態(tài)（綠色）的P19細(xì)胞的融合
膠粘狀態(tài)的HeLa S3（紅）在浮動(dòng)狀態(tài)（綠色）的P19細(xì)胞的融合
熒光標(biāo)記的（* 1）中的紅，附著的細(xì)胞在12孔平板，綠色熒光標(biāo)記（* 2）中，添加預(yù)先準(zhǔn)備的HVJ-E，來處理漂浮細(xì)胞1×105個(gè)的懸浮液（融合緩沖污染），并在室溫下離心（1000轉(zhuǎn)），每個(gè)板5分鐘。隨后孵育37℃15分鐘后，更換增殖用的培養(yǎng)基繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)。觀察3個(gè)小時(shí)后的融合細(xì)胞（黃色）。
◆和PEG法的比較
紅色熒光標(biāo)志(* 1）的ratMSC（骨髓由來老鼠間葉系細(xì)胞）和綠色熒光標(biāo)識(shí)的老鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞2×105個(gè)融合緩沖液50 μL中混合后，添加HVJ – E，冰浴5分鐘，然后37℃孵育反應(yīng)15分鐘，觀察融合細(xì)胞（黃色）。1 - 2日培養(yǎng)后，觀察到粘著的融合細(xì)胞。在PEG法中融合緊接之后細(xì)胞毒性強(qiáng)烈，融合細(xì)胞的數(shù)量很少。
◆安全性說明
HVJ-E失活的確認(rèn)（確認(rèn)無感染性病毒的存在）
| 1. | 細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)（熒光灶單元（FFU）法） 處理LLC-MK2細(xì)胞，一到兩天后，病毒生長(zhǎng)性的HVJ融合蛋白F抗體通過熒光抗體法測(cè)定，已證實(shí)未檢測(cè)到病毒蛋白。<制造階段實(shí)驗(yàn)> |
| 2. | 受精卵生長(zhǎng)試驗(yàn)（血凝單位測(cè)定） 處理受精卵，3天后的病毒增殖，包括在HVJ表面的HN蛋白的紅血細(xì)胞聚合活性（HAU）測(cè)量作為指標(biāo)，已經(jīng)證實(shí)，沒有看到病毒的生長(zhǎng)。<制造階段實(shí)驗(yàn)> |
| 3. | 小鼠感染性研究 鼻腔給藥小鼠和未處理小鼠（SIX周）在相同籠中飼養(yǎng)，通過測(cè)定血清中的抗HVJ抗體滴度進(jìn)行了個(gè)體之間感染性的檢測(cè)。其結(jié)果是，在非給藥的情況下未觀察到抗體滴度增加，表明未感染HVJ-E。 |
| 4. | 動(dòng)物個(gè)體的遺傳基因?qū)雽?shí)驗(yàn) 小鼠、大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各種藥物實(shí)驗(yàn)（肺、氣管、肝和靜脈等）。已證實(shí)*沒有病毒感染或是可疑的事例。 |
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
| 388-18721 | GenomONE® -CF 細(xì)胞融合試劑套裝（1支套裝） | 1 set |
| 384-18723 | GenomONE® -CF 細(xì)胞融合試劑套裝（4支套裝） | 4 sets |
| 382-18724 | GenomONE® -CF 細(xì)胞融合試劑套裝（16支套裝） | 16 sets |
GenomONE ®
仙臺(tái)病毒包膜細(xì)胞融合試劑
Q&A
Q1：什么是GenomONE®-CF EX？
A1：GenomONE®-CF EX是由HVJ包膜（HVJ-E）和特殊緩沖液組成的細(xì)胞融合試劑盒。 它可以用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。 使用該試劑盒融合相同或不同類型的細(xì)胞只需30分鐘。
Q2：HVJ-E的特性？
A2：HVJ包膜是通過*滅活的仙臺(tái)病毒（HVJ：日本血凝素病毒）純化后的產(chǎn)物。 它是一種囊泡，其中僅保留仙臺(tái)病毒具有細(xì)胞膜融合能力的包膜蛋白。 *，在鞘膜外耳炎（包膜）仙臺(tái)病毒中的HN蛋白能識(shí)別細(xì)胞膜上的受體（在糖鏈的末端具有唾液酸）并且將其吸收，從而通過F蛋白（包膜的另一組分）介導(dǎo)膜融合。 HVJ-E中包含的仙臺(tái)病毒基因組RNA已經(jīng)*滅活，并且在人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中既不能感染也沒有增殖潛力。HVJ-E可以在普通實(shí)驗(yàn)室中安全使用，無需任何特殊操作或設(shè)施。
Q3：失效日期？
A3：在鋁紙包裝上印刷了凍干的HVJ-E的保質(zhì)期。
Q4：對(duì)于HVJ滅活方法？
A4：雖然HVJ-E使用HVJ（仙臺(tái)病毒/鼠副流感病毒1）作為原料，但HVJ的基因組RNA已經(jīng)通過藥物治療而*滅
活*。 HVJ-E不會(huì)在人或動(dòng)物中增殖或表現(xiàn)出致病作用。
A4：參考文獻(xiàn)：Prior, P. et al.: BioPharm, 22-33 (Oct. 1996) Kaneda, Y. et al.: Advances in Genetics, 53, 308-332 (2005).
Q5：病毒滅活的評(píng)估和確認(rèn)？
A5：通過對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞和生長(zhǎng)的雞蛋進(jìn)行病毒增殖性電位排除試驗(yàn)，證實(shí)了每批的HVJ已經(jīng)失活。
Q6：確認(rèn)病毒滅活的方法？
A6：通過以下三種方法證實(shí)了在人或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中缺乏HVJ-E的感染或增殖的可能性。
A6：（1）使用培養(yǎng)細(xì)胞的測(cè)定
A6：（2）使用受精的雞蛋進(jìn)行測(cè)定
A6：（3）使用小鼠進(jìn)行測(cè)定
Q7：實(shí)驗(yàn)室生物實(shí)驗(yàn)安全級(jí)別，使用注意事項(xiàng)？
A7：GenomONE® 可以在普通實(shí)驗(yàn)室安全使用。雖然HVJ-E使用HVJ（仙臺(tái)病毒/鼠副流感病毒1）作為原料，但HVJ的基因組RNA已經(jīng)通過藥物治療而*滅活。 HVJ-E不會(huì)在人或動(dòng)物中增殖或表現(xiàn)出致病作用。然而，當(dāng)使用該產(chǎn)品進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)時(shí)，產(chǎn)生的重組生物體等可能屬于卡塔赫納生物安全議定書的限制。
A７：使用本產(chǎn)品生產(chǎn)重組生物體的實(shí)驗(yàn)者必須采取適當(dāng)措施，防止此類生物體擴(kuò)散，然后再使用本產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
A７：此外， DNA重組實(shí)驗(yàn)，必須遵循重組DNA實(shí)驗(yàn)規(guī)則（在使用國(guó)的相關(guān)法規(guī)中規(guī)定或由相關(guān)設(shè)施的安全委員會(huì)規(guī)定），并且實(shí)驗(yàn)只能在具有合適設(shè)施的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行DNA重組實(shí)驗(yàn)。
Q8：質(zhì)量保證？
A8：
A8：◆通過對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞和受精雞蛋的病毒增殖性電位排除試驗(yàn)，確認(rèn)每批HVJ的滅活。
A8：◆無菌檢測(cè)證實(shí)了不存在細(xì)菌和真菌污染。
A8：◆內(nèi)毒素水平已被證實(shí)小于2.5 EU / mL（鱟細(xì)胞裂解物凝膠凝塊測(cè)定）。
Q9：許可證要求和商業(yè)用途？
A9：本產(chǎn)品由一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求所覆蓋，并且僅授予研究用途。 未經(jīng)制造商事先書面許可，不得用于任何商業(yè)或其他目的，或在修改后轉(zhuǎn)售等(Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.)。
Q10：每種試劑的作用？
A10：
A10：◆凍干的HVJ-E：HVJ-E是通過*滅活HVJ（仙臺(tái)病毒）制備的純化囊泡，其中僅保留HVJ具有細(xì)胞膜融合能力的包膜蛋白。
A10：◆HVJ-E懸浮緩沖液：用于復(fù)融，重懸，稀釋HVJ-E或其他目的的生理濃度的中性緩沖液。
A10：◆細(xì)胞融合緩沖液：用于細(xì)胞融合的優(yōu)化緩沖液。
A10：◆ “細(xì)胞融合緩沖液（20X濃縮物）”應(yīng)在使用前用無菌純水（例如，不含內(nèi)毒素的注射用水）以1：20稀釋。
Q11：每種試劑的成分和濃度？
A11：無相關(guān)數(shù)據(jù)
Q12：重組HVJ-E懸浮液的儲(chǔ)存？
A12：
A12：◆為了連續(xù)使用，請(qǐng)?jiān)诒洌?-8°C）存放多兩個(gè)星期。
A12：◆對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，根據(jù)每次使用量將試劑分裝保存在-80℃下冷凍多3個(gè)月。 冷凍后只能解凍一次。
Q13：“HVJ-E懸浮緩沖液”和“細(xì)胞融合緩沖液（20X）”的保存？
A13：儲(chǔ)存在冰箱（2-8°C）。 不要凍結(jié)。
Q14：HVJ-E的粒度？
A14：約300nm（200-400nm）
Q15：HVJ-E顆粒數(shù)？
A15：40mL復(fù)融的HVJ-E懸浮液包括約109-1010個(gè)HVJ-E顆粒。
Q16：HVJ-E的血細(xì)胞凝集單位（HAU）？
A16：40mL復(fù)融的HVJ-E懸浮液，相當(dāng)于約1,000-2,000個(gè)血凝單位（HAU）。
Q17：使用頻率？
A17：
A17：◆對(duì)于相同或不同類型的細(xì)胞的融合：約100次
A17：◆用于制備B細(xì)胞雜交瘤：約10次