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新型親和法外泌體提取試劑盒

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS

　　MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 PS采用磷酯酰絲氨酸（PS）親和Tim4蛋白固化磁珠（PS親和法）的方法可以簡便快捷地提取高純度的完整外泌體和其他細胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高純度的外泌體，請使用10,000×g離心后的上清。

　　該試劑盒使用含有EDTA的中性洗脫緩沖液將外泌體完整洗脫下來，所提取的完整外泌體和其他EVs可用于不同實驗，包括電鏡分析（TEM）、納米粒子追蹤（NTA）分析、投喂實驗、分子組成（蛋白質、脂質、核酸等）分析等。

◆膜表面磷酯酰絲氨酸（PS）親和法

　　Tim4蛋白固化磁珠，在金屬離子存在的條件下親和細胞外囊泡表面的磷酯酰絲氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脫液進行洗脫，捕獲高純度的完整細胞外囊泡

◆優(yōu)點?特色

使用新型親和提取方法

無需進行超離

●　使用磁珠改進了操作

●　流程優(yōu)化

※　高重復性

樣品類型：細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿、尿液等。

●　可以純化高純度和完整的細胞外囊泡

●　可以從細胞上清液、血清、血漿和尿液中純化外囊泡

●　重復性高，回收量穩(wěn)定

●　簡易操作（約3.5小時）

●　啟用多個樣品（無需超速離心）

◆試劑盒組成

*每套試劑盒能完成5次回收實驗，即實際使用量為10×5次/Kit與2×5次/Kit

◆案例•應用

從血清、血漿、尿液中提取的細胞外囊泡的分析

從人血清中提取外泌體的產量比較

　　使用該試劑盒，超離法和抗體親和法提取人血清的外泌體，接著用CD9和CD63抗體進行免疫印跡實驗。

●　檢測抗體

      抗CD9兔多抗，System Bioscience公司

      抗CD63兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印跡（WB）數據

      各樣品結果相當于150 μL的血清樣本。從100 μL提取物中取出15 μL，添加5 μL的4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

從人EDTA血漿中提取外泌體

　　分別從1 mL的EDTA血漿、EDTA血漿（超濾更換緩沖液）、人血清中提取外泌體，進行WB檢測（抗Flotillin2抗體）。

●　檢測抗體

      抗Flotillin-2小鼠單抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司

●　使用樣品量

      各1 mL

●　免疫印跡（WB）數據

      各樣品結果分別對應150 μL樣品量。從100 μL提取物中取出15 μL，添加5 μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

從人尿液中提取外泌體的回收量比較

　　1 mL人尿液分別通過本試劑盒、聚合物沉淀法、超離法進行外泌體回收，并做免疫印跡（WB）檢測（抗CD9抗體）。

●　檢測抗體

      抗CD9兔多抗，System Biosciences公司

●　使用樣品量

      各1 mL

●　免疫印跡（WB）數據

      各樣品結果分別對應150 μL尿液樣品。從100 μL提取物中取出15 μL，加入5 μL的 4×SDS樣品緩沖液，全部上樣。

◆與傳統(tǒng)沉淀法的功能比較實驗

　　分別用本試劑盒、超離心法和聚合物沉淀法從K562（人慢性骨髓性白血?。┘毎囵B(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)上清或10%Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基）提取外泌體，分別比較三種方法的外泌體回收量和外泌體純度。

MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS【PS親和法】

　　按照試劑盒的操作說明（反應時間：3小時），從1 mL經過離心處理（10,000×g，30min）的K562細胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）中提取外泌體。

超速離心法

　　將10 mL經過離心處理（10,000×g，30 min）的K562細胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）進行超離（110,000×g，70 min），用TBS緩沖液重懸沉淀物后，再進行超離（110,000×g，70 min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

　　從1 mL經過離心處理（10,000×g，30 min）的K562細胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基或10% Exosome-depleted FBS添加培養(yǎng)基※1）中，按照市售的A公司產品的操作說明（靜置時間：過夜）提取外泌體。

※1：110,000×g離心2小時，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

比較提取的外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）分析結果和納米粒子追蹤（NTA）分析結果

　　分別用本試劑盒、超離法、聚合物沉淀法提取外泌體，用NanoSight LM10檢測外泌體片段的粒子直徑。另外，用終濃度為2%的多聚甲醛固定提取到的外泌體片段（2~4×10¹⁰ particles），在透射電子顯微鏡進行分析。

電子顯微鏡圖像 數據提供：金澤大學 醫(yī)學系 華山教授、大阪大學 iFReC 中井先生

MagCapture™ 可提取到很多100 nm左右的粒子，在透射電子顯微鏡中也可以確認到很多細胞外囊泡。

K562細胞培養(yǎng)上清提取的外泌體回收量和純度的比較（無血清培養(yǎng)基）

　　用PS親和法、超離法和聚合物沉淀法從K562 細胞培養(yǎng)上清（無血清培養(yǎng)基）獲得樣品進行電泳。接著用銀染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗體）進行實驗。

回收量，不是回收率

●　檢測抗體

     抗CD63小鼠單抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2 小鼠單抗  （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠單抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司

K562細胞培養(yǎng)上清提取外泌體的回收量和純度的比較（10%FBS-添加培養(yǎng)基）

　　用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 、超離法和聚合物沉淀法，從K562 細胞培養(yǎng)上清（10% 去外泌體 FBS補充培養(yǎng)基）獲得樣品進行電泳，用銀染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗體）進行實驗。同時，對外泌體提取片段進行質譜測定，比較所有測定的多肽中來自K562細胞的人來源多肽的比例（由于添加到細胞培養(yǎng)基的FBS中牛蛋白聚集體是混雜的，所以人來源多肽的比率會下降）。

●　檢測抗體

     抗CD63小鼠單抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2小鼠單抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠單抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司

     健康人血清來源的外泌體中提取miRNA和mRNA的回收量比較

實驗數據

①運用不同方法提取外泌體并比較從中提取的microRNA和mRNA的回收量

通過超離法和PS親和法將EVs從正常人血清中分離，然后使用microRNA提取試劑盒（產品編號295-71701）提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

相比超離法，PS親和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高產量。

②運用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比較

　　運用PS親和法將EVs從正常人血清中分離，然后使用microRNA提取試劑盒（產品編號295-71701）或基于AGPC法的試劑提取RNA。通過qRT-PCR分析提取的RNA，并比較microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

對比AGPC法，使用microRNA提取試劑盒更能有效提取PS親和法純化所得EVs中的microRNA和mRNA

◆外泌體蛋白質組學分析

<實驗內容及結果>

　　分別利用PS親和法、超離法、聚合物沉淀法，從含10% FBS（不含外泌體）的K562細胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體。將提取樣品用10%聚丙烯酰胺電泳分離，剪切出全部的蛋白質條帶。然后在凝膠內進行消化，用LC-MS對蛋白質進行檢測。對上述三種方法提取的外泌體進行蛋白質組合的相關性比較。

比較通過MASS分析鑒定的*個蛋白質

白色柱：源自外囊泡的人類蛋白質

灰色柱：來自FBS的牛蛋白污染物

紅色：來自外囊泡的標記蛋白

樣品：K562細胞培養(yǎng)基（含有10%去除外泌體胎牛血清）

成對組合相關性比較

◆應用數據

Protein Assay BCA Kit檢測外泌體的蛋白質濃度

　　Protein Assay BCA Kit是利用二辛可寧酸（BCA）定量檢測溶液中的蛋白質濃度的試劑盒，是蛋白質定量檢測法中的方法。其原理為，堿性條件下的蛋白質Cu²⁺ 離子被還原為Cu⁺。Cu⁺與BCA形成絡合物，即產生紫色螯合物，蛋白質濃度與紫色螯合物顏色深淺有關，通過測定562 nm處的吸光度，并與標準曲線做比照，即可定量溶液中的蛋白質濃度。

利用MagCapture™外泌體提取試劑盒從細胞培養(yǎng)上清液中提取外泌體，通過Protein Assay BCA Kit高靈敏的檢測外泌體中蛋白質濃度。

【實驗內容及結果】

　　將通過MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的25 μL外泌體溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中試劑A和試劑B混合液200 μL。之后60℃孵育30分鐘，檢測560 nm吸光度（圖1）。結果表明，通過Protein Assay BCA Kit的高靈敏度檢測，可測定提取后外泌體中蛋白質濃度。

圖1. Protein Assay BCA Kit 檢測BSA的檢量線和提取的外泌體蛋白質濃度的檢測

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌體蛋白質濃度相當低，因此BCA測定時不要稀釋樣品。

①　將BSA標準溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625 μg／mL和空白對照，分別每孔25 μL加到96孔板中。

②    分別把提取的外泌體和洗脫緩沖液（空白）按照每孔25 μL加入96孔板。

③    把200μL Protein Assay BCA Kit（產品編號：297-73101）的試劑A盒試劑B混合液（A:B=50:1）加入放有樣品的孔板中。

④    60℃孵育30分鐘

⑤    室溫條件下降低孔板溫度

⑥    測定560 nm的吸光度

◆外泌體的標記和Hela細胞導入實驗

【實驗概要】

用PKH67（Sigma公司）標記MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取的細胞外囊泡， Hela細胞導入確認

<外泌體PKH67標記>

1. MagCapture™ 外泌體提取試劑盒提取外泌體（實驗當天從K562細胞培養(yǎng)上清液提取外泌體）

2. 用BCA Assay和NanoSight檢測樣品的蛋白質濃度和粒子濃度

3. 將相當于5 μg*蛋白量的外泌體樣品溶液分裝至1.5 mL管中。

*請配制合適的使用量

4. 將2.0 μL的PKH linker溶解在0.25 mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*請配制合適的使用量

5. 添加1/3樣品量的4×Dye solution至樣品中，混合后在室溫中孵育5-10分鐘。

6. 根據附帶的操作說明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo公司）。

7. 將100 μL樣品分別加入上述平衡后的旋轉柱*中，離心（大添加量：100 μL）。

*準備必需的支數。

8. 將外泌體溶液*加入到已經接種好Hela細胞的培養(yǎng)皿中，24小時后用顯微鏡觀察并利用流式細胞儀進行分析。

*根據實驗調節(jié)外泌體添加量

圖1. PKH標記外泌體的細胞捕獲觀察

從16 mL K562培養(yǎng)上清液中超濾濃縮得到4 mL培養(yǎng)上清液作為樣品，通過PS親和法提取外泌體。

●　提取的外泌體蛋白質濃度：22.3 ng/μL

●　粒子濃度：1.2×10⁸ particles/mL

將上述標記的外泌體溶液全部加入接種好的Hela細胞中，24小時后用熒光顯微鏡（左）和流式細胞儀（右）檢測捕獲情況。

Opti-MEM：取相同量用PKH標記后添加到細胞中作為陰性對照。

◆細胞培養(yǎng)上清•血清•血漿的預處理操作

　　樣品預處理：對樣品進行1,200×g離心操作^※1。如果要得到更高純度的外泌體，則按照下述步驟對樣品進行10,000×g離心操作^※2。

　　下文是細胞培養(yǎng)上清、血清/血漿的預處理方法。其他體液樣品的預處理操作，請參考血清/血漿的實驗步驟，做適當調整。

更換緩沖液（限制過濾）操作

用50 mL TBS 緩沖液對1 mL 已經經過離心處理的EDTA 血漿樣品進行緩沖液更換。

1. 把19 mL TBS 加進VivaSpin20（100K）中。

2. 把1 mL 離心過的EDTA 血漿上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，混勻。

3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下進行離心處理。

4. 減少上線的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 緩沖液。

5. 4℃下離心處理。

6. 減少上面的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 緩沖液。

7. 4℃下離心處理。

8. 減少上面的液體后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 緩沖液。

9. 4℃下離心處理直至樣品液量達到1 mL 以下。

10. 進行提取。

◆MagCapture™ 外泌體提取試劑盒 操作步驟

◆產品列表

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MagCapture™ 外泌體提取試劑盒