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LipiRADICAL Green（檢測試劑）/OH-Pen（抑制物質(zhì)）

脂質(zhì)過氧化研究的新工具！脂質(zhì)自由基檢測試劑和抑制物質(zhì)

LipiRADICAL Green是特異性熒光檢測脂質(zhì)過氧化反應的上游因子脂質(zhì)自由基的試劑?？捎糜诨罴毎上?、樣品中脂質(zhì)自由基含量的相對定量以及樣品中脂質(zhì)自由基的結構分析和全面鑒定。另外，OH-Pen還可作為脂質(zhì)自由基特異性中和劑使用。

※ 本產(chǎn)品基于九州大學大學院藥學研究院 生命物理化學領域 山田健一教授的研究結果商品化并銷售。

※ 本產(chǎn)品僅供研究用，研究以外不可使用。

本試劑的概要圖和活細胞成像示例

脂質(zhì)自由基發(fā)生特異性反應產(chǎn)生綠色熒光的LipiRADICAL Green原理示意圖（左），以及Hepa1-6細胞被藥物刺激時的活細胞成像示例（右）。

◆什么是脂質(zhì)過氧化反應（LPO）和脂質(zhì)自由基（Lipid radical）？

脂質(zhì)過氧化反應（lipid peroxidation; LPO）是指由于氧化應激脂質(zhì)被氧化分解的反應，是脂質(zhì)分解的過程之一。以含有多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid; PUFA）的脂質(zhì)為起點，目前已提出兩種脂質(zhì)過氧化反應的發(fā)生過程：

1.氧化應激引起的脂質(zhì)自由基產(chǎn)生

2. Lipoxygenase引起的過氧化脂質(zhì)生成和鐵離子依賴性過氧化脂質(zhì)自由基的產(chǎn)生

第1種發(fā)生過程是由含PUFA的脂質(zhì)暴露于氧化應激（活性氧ROS）時產(chǎn)生脂質(zhì)自由基（L.；Lipid radical）開始。脂質(zhì)自由基容易被氧化并轉化為過氧化脂質(zhì)自由基（LOO?; Lipid peroxyl radical），誘導自由基連鎖反應。在第2種發(fā)生過程中，含PUFA的脂質(zhì)被過氧化催化酶lipoxygenase轉化為過氧化脂質(zhì)（LOOH），并在存在大量的鐵離子Fe²⁺ 時會誘導產(chǎn)生過氧化脂質(zhì)自由基（LOO?）。過氧化脂質(zhì)自由基與其他脂質(zhì)反應，誘導自由基連鎖反應。

兩種過程所產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)自由基（LOO?）都會在與其他脂質(zhì)發(fā)生自由基反應并擴大自由基連鎖反應，同時產(chǎn)生各種過氧化脂質(zhì)（LOOH）。該自由基連鎖反應直至被抗氧化劑聚合前會持續(xù)進行，并生成各種脂質(zhì)結構或醛，終產(chǎn)生復數(shù)的反應活性醛，如acrolein、malondialdehyde（MDA）、4-hydroxy-2-nonenal （4-HNE）等。以這些下游活性物質(zhì)為起因，會對ER應激、細胞毒性和誘導鐵死亡等產(chǎn)生各種影響。

脂質(zhì)自由基（以及過氧化脂質(zhì)自由基）被認為是脂質(zhì)過氧化反應中重要的上游因子，雖然其檢測方法備受期待，但直到現(xiàn)在，也僅有電子自旋共振（ESR）法等需要特殊設備的方法。LipiRADICAL Green和OH-Pen是由九州大學大學院藥學院研究院生命物理化學系的山田健一教授等人開發(fā)的、具有新型氮氧化物骨架的脂質(zhì)自由基響應性熒光試劑（原*稱為NBD-Pen）和抑制劑，它們不與活性氧自由基反應，實現(xiàn)特異性響應脂質(zhì)自由基。由于LipiRADICAL Green可通過熒光檢測來觀察/分析脂質(zhì)自由基，因此可用作以脂質(zhì)自由基為中心的脂質(zhì)過氧化反應的新工具。OH-Pen是從LipiRADICAL中去除熒光基團NBD的化合物，與一般的自由基中和劑（TEMPO等）不同，對脂質(zhì)自由基顯示高選擇性，可作為脂質(zhì)過氧化反應的特異性抑制劑使用。

◆原理

LipiRADICAL Green是向穩(wěn)定自由基化合物的氮氧化物衍生物中添加熒光色素NBD的化合物。由于氮氧化物對脂質(zhì)自由基顯示高特異性，所以導入了戊基。LipiRADICAL Green此時處于消光狀態(tài)，但通過脂質(zhì)自由基與自由基-自由基偶聯(lián)形成共價鍵后，顯示綠色熒光。通過觀察該綠色熒光強度，可相對定量樣品中脂質(zhì)自由基含量。

OH-Pen是LipiRADICAL Green的NBD轉化為羥基的化合物，顯示相同的脂質(zhì)自由基選擇性以及擁有相同的脂質(zhì)自由基中和作用。因此可將其用作脂質(zhì)過氧化反應的抑制劑。

概述：對使用LipiRADICAL Green的脂質(zhì)自由基進行全面分析

通過使用LipiRADICAL Green的熒光檢測LC/MS-MS法可全面分析脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基。原著論文5中，已成功地從5種類型的PUFA中鑒定出共計132種脂質(zhì)自由基。以下為流程概述，詳細的實驗方案、LC/MS-MS設置方法/分析方法，請參閱原著論文5。

■概述

◆特點

LipiRADICAL Green

●　本試劑為消光狀態(tài)，與脂質(zhì)自由基/過氧化脂質(zhì)自由基特異性反應，發(fā)出綠色熒光。

●　檢測波長標準：激發(fā)470 nm /熒光520-600 nm（大~540 nm）。 

※ 詳情請參閱數(shù)據(jù)。

●　對脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基具有特異性，在活性氧（H₂O₂、ClO^-?、O₂^-?、?OH）中不發(fā)出熒光。

●　可通過熒光強度相對定量體外樣品中的脂質(zhì)自由基含量。

●　施藥于動物個體后，可在組織水平上進行染色以及相對定量活體內(nèi)的自由基含量。

※ 由于脂質(zhì)自由基非常不穩(wěn)定且會迅速分解，需要對實驗方法和條件設置進行驗證。詳情請參閱原著論文1。

●　可用于評價任意化合物的脂質(zhì)自由基誘導活性和抗氧化活性。

※ 詳情請參閱原著論文4。

●　通過用熒光檢測LC/MS可全面結構分析脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基。

※ 脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基的結構分析方法，請參考原著論文5。

OH-Pen

●　與脂質(zhì)自由基和過氧化脂質(zhì)自由基發(fā)生特異性反應以抑制自由基連鎖反應，可用作脂質(zhì)過氧化反應信號上游的抑

      制劑。

●　雖然是自由基化合物，但非常穩(wěn)定，可體外施藥至動物個體。

●　肝細胞癌的動物實驗模型（diethylnitrosamine（DEN）給藥模型）中顯示，可抑制DEN誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反

      應信號和組織損傷標志物。

注意：LipiRADICAL Green和OH-Pen的區(qū)別在于有無熒光基團（請參閱“原理”），對脂質(zhì)自由基的反應性相

          同，同時使用時，可能會引起對脂質(zhì)自由基的競爭性反應，因此需注意使用方法。

◆原著論文

1)　Yamada Nat. Chem.Biol.,12,608～613(2016)Fluorescence probes to detect lipid-derived radicals.

2)　Enoki et al., Chem.Commun.,53,10922～10925(2017)Lipid radicals cause light-induced retinal 

   　degeneration.

3)　Ishida et al., Free Radical Biol.Med.,113,1487～493(2017)Detection and inhibition of lipid-derived 

   　radicals in low-density lipoprotein.

4)　Mishima et al., J.Am. Soc.Nephrol.,31,280～296 (2020)Drug Repurposed as antiferroptosis agents 

   　suppress organ damage, including AKI, by functioning as lipid peroxyl radical scavengers.

5)　Matsuoka et al.,Anal. Chem.,92,6993～7002(2020)Method for Structural Determination of Lipid-

   　Derived Radicals.

◆參考數(shù)據(jù)

脂質(zhì)自由基特異性熒光光譜

添加花生四烯酸（AA）和Lipoxygenase（LOX）至LipiRADICAL Green，觀察470 nm的激發(fā)熒光。在未添加LOX的條件下，幾乎沒有觀察到熒光，而添加LOX并產(chǎn)生脂質(zhì)自由基后，可觀察到500-650 nm范圍內(nèi)的熒光（大540 nm附近）（左）。由此看出，熒光強度取決于添加的LOX濃度（右）。

自由基特異性

觀察在以下條件中添加各試劑至LipiRADICAL Green的熒光強度（激發(fā)470 nm/熒光530 nm）?？捎^察到活性氧中的熒光幾乎沒有變化，而通過LOX酶或氧化誘導物質(zhì)（AAPH和MeO-AMVN）的3種脂質(zhì)產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基產(chǎn)生時的熒光強度有所上升。

H₂O₂, ClO^- , KO₂（O₂^-?）,?OH ：0.5 mM Lipids 0.5 mM (LA: linoleic acid, ALA: α-linoleic acid, AA: arachidonic acid ) + LOX 2.5 μg/mL or AAPH 10 mM or MeO-AMVN 50 μM

◆應用數(shù)據(jù)

活細胞成像

添加LipiRADICAL Green（1 μM）至Hepa1-6細胞培養(yǎng)20 min后，追加致癌性亞硝胺化合物DEN（30 mM）培養(yǎng)20 min，然后每隔2 min用激光共聚焦熒光顯微鏡進行活細胞成像（激發(fā)458 nm/熒光490-674 nm）。經(jīng)DEN處理的細胞在添加試劑后，熒光強度立即隨培養(yǎng)時長的增加而增加，這表明DEN是按順序產(chǎn)生脂質(zhì)自由基的。熒光顯微鏡圖像為添加試劑后20 min內(nèi)的數(shù)據(jù)。

體外檢測LDL來源的脂質(zhì)自由基

用氧化誘導物質(zhì)Hemin或AAPH處理純化的低密度脂蛋白LDL（20 μg protein/mL），添加LipiRADICAL Green（10 μM）并觀察1 h內(nèi)的熒光強度（激發(fā)470 nm/熒光530 nm），可檢測到Hemin、AAPH隨時間推移和試劑濃度依賴性熒光強度的增加，出現(xiàn)了不同的增加趨勢。

脂質(zhì)自由基結構分析

1）評價由氧化誘導劑（AAPH + Hemin）產(chǎn)生的自由基

體外添加LOX（10 μg/mL）和氧化誘導物質(zhì)AAPH+Hemin（10 μM）至花生四烯酸（AA）中，誘導脂質(zhì)自由基后添加LipiRADICAL Green并進行檢測反應。之后通過Bligh＆Dyer法純化脂質(zhì)成分，并用熒光LC/MS-MS對AA產(chǎn)生的自由基進行全面分析。

上圖：熒光LC色譜（激發(fā)470 nm/熒光530 nm）。檢測出多個峰，對各個峰進行MS-MS分析。

下圖：用MS-MS分析比較經(jīng)鑒定的各種脂質(zhì)自由基生成量（注：用各自由基種類的LC峰面積的相對定量）。鑒定

          出8種類型的AA過氧化脂質(zhì)自由基（圓圖中的紅線），此外還鑒定了由AA裂解產(chǎn)生的29種脂質(zhì)自由基（條

          形圖、綠線）。

* 有關詳細的實驗方案和分析方法，請參閱原著論文5。

2）DEN誘導時內(nèi)源性產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基檢測

向小鼠施以致癌性亞硝胺化合物DEN，分別在1 h、4 h、24 h后進行麻醉，向腹腔內(nèi)施以LipiRADICAL Green，之后切除肝臟并壓碎，用Bligh＆Dyer法制備脂質(zhì)提取液。并用熒光LC/ MS對各提取物進行各脂質(zhì)自由基的鑒定以及相對定量。另外，NBD-Pen給藥前15 min先施以脂質(zhì)自由基抑制劑OH-Pen?？捎^察到左圖所示的熒光LC色譜圖，用MS/MS分析鑒定出共計11種類型的脂質(zhì)自由基。隨時間觀察各脂質(zhì)自由基種類（右圖為C₅H₁₁的檢測結果），可觀察到DEN給藥4 h后質(zhì)譜峰面積大幅增加，而24 h后減少。LipiRADICAL Green給藥前，經(jīng)OH-Pen處理的小鼠脂質(zhì)自由基被明顯抑制。

* 有關詳細的實驗方案和分析方法，請參閱原著論文5。

3）使用本試劑進行體外鑒定脂質(zhì)自由基

使用本試劑從5種PUFA【亞油酸（LA），α-亞麻酸（ALA），花生四烯酸（AA），二十二碳六烯酸（DHA），二十碳五烯酸酯（EPA）】中經(jīng)LOX、AAPH以及Hemin處理后鑒定的脂質(zhì)自由基列表如下（摘自原著論文5）。

通過OH-Pen抑制亞硝胺誘導肝細胞癌

向大鼠施以致癌性亞硝胺化合物DEN后，1 h后再施以OH-Pen。分別切除慢性模型12周后和急性模型24 h后的大鼠肝臟。

上圖：慢性模型的肝癌。DEN給藥使惡性腫瘤亢進，而施以OH-Pen可明顯抑制該反應。

中圖：急性模型LPO代謝產(chǎn)物的定量評價。發(fā)現(xiàn)OH-Pen抑制了DEN引起的MDA、4-HNE及Acrolein這三種LPO下

          游產(chǎn)物的增加。

下圖：急性模型組織損傷標記物的定量評價。發(fā)現(xiàn)OH-Pen抑制了DEN引起的8-OHdG、ALT及細胞凋亡量的增

          加。

這些結果顯示，DEN引起LPO亢進并產(chǎn)生脂質(zhì)自由基后會誘導各種毒性信號，但OH-Pen可通過抑制初期脂質(zhì)自由基連鎖反應來抑制癌變。

◆產(chǎn)品列表