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詳細(xì)介紹
無動(dòng)物參與的皮膚致敏試驗(yàn)方法
ADRA試劑盒
ADRA（Amino acid Derivative Reactivity Assay，氨基酸衍生物反應(yīng)法）是應(yīng)用了N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-cysteine【NAC】和α-N-(2-(1-naphthyl) acetyl)-L-lysine【NAL】的化學(xué)品皮膚致敏試驗(yàn)方法，該方法無動(dòng)物參與，是動(dòng)物皮膚致敏試驗(yàn)的替代方法，符合OECD TG442C（經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織化學(xué)品 TG442C測(cè)試準(zhǔn)則）。
◆原理
皮膚致敏是由致敏物質(zhì)與蛋白結(jié)合形成復(fù)合物（KE1）開始的，該復(fù)合物通過致敏物質(zhì)與蛋白中的半胱氨酸的巰基或賴氨酸的氨基的共價(jià)結(jié)合所得。ADRA試驗(yàn)利用NAC（半胱氨酸衍生物）和NAL（賴氨酸衍生物）替代蛋白，通過NAC、NAL和待測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)來預(yù)測(cè)待測(cè)物質(zhì)與蛋白的結(jié)合性。
ADRA試驗(yàn)通過將NAC、NAL溶液與待測(cè)物溶液混合，在25°C下反應(yīng)24小時(shí)，然后用HPLC法對(duì)反應(yīng)溶液中殘留的NAC和NAL的濃度進(jìn)行定量，從而對(duì)待測(cè)物質(zhì)的皮膚致敏性進(jìn)行評(píng)估。
◆優(yōu)點(diǎn)
● 靈敏度高：在相對(duì)長(zhǎng)的波長(zhǎng)下（281 nm）檢測(cè)，可防止待測(cè)樣品和親核試劑的共洗脫。
● 沉淀少：ADRA試驗(yàn)所需反應(yīng)物的濃度僅為DPRA法的1%，可避免沉淀的產(chǎn)生。
● 重復(fù)性好：在HPLC分析前，通過添加終止液（2.5％TFA）來終止反應(yīng)，因此檢測(cè)的可重復(fù)性好。
● 高通量：ADRA試驗(yàn)使用96孔板和多通道移液器，可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定多個(gè)樣品。
◆試劑盒組成
試劑名稱 | 容量 | 包裝 |
NAC | 10 mL用 | 2瓶 |
NAL | 10 mL用 | 2瓶 |
NAC 緩沖液 (pH 8.0) （預(yù)混合） | 300 mL用 | 2瓶 |
NAL 緩沖液 (pH 10.2) （預(yù)混合） | 300 mL用 | 2瓶 |
0.01 mol/L EDTA溶液 | 1 mL | 2瓶 |
◆使用方法
用水將預(yù)混合緩沖液溶解，再將NAC和NAL溶于其中，然后在96孔板與待測(cè)物反應(yīng)24小時(shí)后，通過HPLC即可進(jìn)行分析。
預(yù)混緩沖液、NAC和NAL都已經(jīng)按照反應(yīng)所需的量分裝好，只需進(jìn)行溶解即可用于ADRA試驗(yàn)。
◆操作視頻
● 緩沖液的制備
● Day1 反應(yīng)溶液的制備
● Day2 反應(yīng)的終止
◆其他需要用到的試劑·實(shí)驗(yàn)器材
試劑
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 包裝 |
204-02743 | Trifluoroacetic Acid | 和光特級(jí) | 25 mL |
015-08633 | Acetonitrile | 高效液相色譜儀用 | 3 L |
217-01031 | Ultrapure Water | 超微量分析用 | 1 L |
016-00346 | Acetone | 試劑特級(jí) | 500 mL |
043-07216 | Dimethyl Sulfoxide | 試劑特級(jí) | 500 mL |
* 蒸餾水或更高級(jí)別的水（ADRA試驗(yàn)需要使用金屬含量低的水。）
* * 請(qǐng)勿在被測(cè)物質(zhì)溶于水或乙腈時(shí)使用。
※ 需要用苯.乙醛 (CAS RN® 122-78-1)作為陽性對(duì)照化合物。
實(shí)驗(yàn)器材
● 電子天平：精.準(zhǔn)到0.1 mg
● 微量移液槍：量程為2～10 µL、10～100 µL和100～1000 µL的3種移液槍
● 12道移液器：量程為50～150 µL
● HPLC系統(tǒng)：配套96孔用遮光自動(dòng)進(jìn)樣器，以0.3 mL/min流速進(jìn)樣
● UV檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（PDA檢測(cè)器）或吸光度檢測(cè)器（281 nm）
● HPLC柱：Wakopak® Core C18 ADRA Φ3.0 × 150 mm（粒徑：3.6 μm）（產(chǎn)品編號(hào)：233-63991）
● HPLC柱：或同類型產(chǎn)品
● pH計(jì)：pH可讀取到±0.01，并配套校準(zhǔn)用緩沖液
● 恒溫箱：溫度可設(shè)定為25℃
● 96孔板
● 500 mL PE瓶
● 試管混合器
● 微孔板封板膜：島津GLC封板膜（產(chǎn)品編號(hào)：568-RES001）或同類型具有高密封性和耐溶劑性的產(chǎn)品
● 微孔板振蕩器
● 微孔板離心機(jī)
※ | ADRA中用到的所有容器或器具（HPLC組件除外），要求使用PP或PE制的一次性用品。金屬離子的混入會(huì)使NAC二聚化從而導(dǎo)致無法正確進(jìn)行評(píng)估。 |
◆產(chǎn)品列表
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 包裝 |
296-80901 | ADRA Kit | for Skin Sensitisation Test | 1 kit |
◆相關(guān)產(chǎn)品
ADRA色譜柱
◆相關(guān)應(yīng)用
皮膚致敏試驗(yàn)替代法ADRA應(yīng)用實(shí)例：使用Wakopak® Core C18 ADRA色譜柱對(duì)"ADRA"中常見化合物進(jìn)行分析