細胞核和細胞質(zhì)蛋白質(zhì)的提取不僅可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位，而且在許多情況下也是如此。提取蛋白可用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究，如Western印跡、電泳遷移率轉(zhuǎn)移測定（EMSA）、足跡分析、轉(zhuǎn)錄測定，或作為純化調(diào)控蛋白的起點。細胞核和細胞質(zhì)蛋白提取試劑盒能夠從哺乳動物培養(yǎng)的細胞或組織中逐步分離和制備粗細胞質(zhì)和細胞核提取物。該試劑盒的基礎(chǔ)是允許細胞在低滲緩沖液中膨脹。然后細胞被破壞，細胞質(zhì)部分被去除，核蛋白通過高鹽緩沖液從細胞核中釋放出來。未變性的活性蛋白質(zhì)在不到兩小時的時間內(nèi)被純化

艾美捷細胞核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒：

Cat #: D-AKE3001

Size: 50T

Storage: Stored at -20°C for 12 months

供應(yīng)材料和儲存條件：

試劑準(zhǔn)備

工作細胞質(zhì)溶液A（工作CESA）：使用前，將10μL蛋白酶抑制劑（100×）和2μL DTT（500×）加入1mL CESA中，置于冰上，在4℃下儲存。

細胞質(zhì)溶液B（CESB）：供應(yīng)即用。使用前放在冰上，4℃保存。

工作核提取溶液（工作NES）：使用前，將10μL蛋白酶抑制劑（100×）和2μL DTT（500×）添加到1 mL NES中，置于冰上，在4°C下儲存。

DTT（500×）：隨附隨用。使用前放在冰上；儲存溫度為-20°C。剩余的工作解決方案可以是

等分后保存于-20℃，避免重復(fù)凍融。

蛋白酶抑制劑（100×）：隨附即用。使用前放在冰上；儲存在-20°C。剩余工作

溶液等分后可在-20°C下儲存，以避免重復(fù)冷凍和解凍。

細胞核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒化驗程序：

注：在2-8°C溫度下執(zhí)行所有步驟。使用預(yù)冷緩沖器和設(shè)備。確保所有溶液均已解凍且均勻。

I-A細胞培養(yǎng)制劑

1.對于粘附細胞，收獲2×10? 用細胞刮刀對細胞進行刮除，然后在500 g離心5分鐘。對于懸浮細胞，通過在500 g下離心5分鐘來收獲。

2.通過用冷PBS懸浮細胞顆粒來洗滌細胞。以500g離心2-3分鐘，并丟棄PBS。

注意：使用移液管小心取出并丟棄PBS，使細胞顆粒盡可能干燥。

3.向細胞沉淀中加入200μl冷加工CESA。進行程序Ⅲ。

1-B組織制備

1.將30-60毫克的組織切成小塊，放入離心管中。

2.用PBS清洗紙巾。將組織以500g離心5分鐘，并丟棄PBS。

注意：使用移液管小心取出并丟棄PBS，使樣品盡可能干燥。

3.將組織在200μl冷的CESA中輕輕復(fù)蘇。

4.使用Dounce勻漿器勻漿組織，直到90%以上的細胞破碎，并在顯微鏡下觀察細胞核。繼續(xù)步驟III。

ll細胞質(zhì)和細胞核蛋白質(zhì)提取：

1.在最高設(shè)置下劇烈渦旋試管15 s，以完-全懸浮細胞顆粒。將試管在冰上培養(yǎng)15分鐘，使細胞膨脹。

2.向試管中加入10μL冷的CESB。在最高設(shè)置下使管子渦旋10-15秒。將試管在冰上培養(yǎng)1-2

最小。

3.將試管在4℃下以16000 g離心5分鐘。

4.立即將上清液（細胞質(zhì)提取物）轉(zhuǎn)移到干凈的冷管中。將此試管放置在冰上直到使用，或在-80°C下保存更長時間。顆粒（含有核）通常是粘性的，并且不是很緊密。

可選：為了去除細胞核中殘留的細胞質(zhì)蛋白，用額外的coldWorking CESA緩沖液或PBS沖洗顆粒。然后重復(fù)步驟3和4中的步驟lll 1-2次。

5.加入100μL預(yù)冷的工作NES，重新懸浮顆粒。將樣品放在冰上，每10分鐘繼續(xù)渦旋15秒，持續(xù)30分鐘。避免形成泡沫。

6.在4℃下以16000 g離心15分鐘。

7.將上清液（核蛋白）加入冷離心管中，取出小份進行蛋白質(zhì)定量檢測。將其他含有核蛋白的離心管儲存在-80°C。避免反復(fù)結(jié)冰和滑行。

注：根據(jù)方案提取的核蛋白懸浮在高鹽緩沖液NES中。如果在隨后的應(yīng)用中需要大量的核提取物，或者如果下游分析出現(xiàn)問題，則在使用前對核提取物進行透析以去除多余的鹽。