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   　Bio-RadPCR儀 - 技術(shù)原理;

　　DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈,當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過(guò)溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

　　但是,DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活,因此,每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價(jià)格昂貴,制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個(gè)循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,并逐步應(yīng)用于。

　　1)內(nèi)參照法:在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高 效液相分離開(kāi)來(lái),分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

　　2)競(jìng)爭(zhēng)法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增(其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記)。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測(cè)模板不被酶切,可通過(guò)電泳或高 效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi),分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

　　3)PCR-ELISA法:利用或生物等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗或生物酶標(biāo)-辣根酶結(jié)合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

　　BioRad酶標(biāo)儀熒光分析技術(shù)是一種強(qiáng)大的分析手段，廣泛地應(yīng)用在臨床檢驗(yàn)、生物學(xué)研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、食品和環(huán)境科學(xué)中，是多功能酶標(biāo)儀的重要應(yīng)用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek（Synergy 4等），MD（M2、M5）都可以應(yīng)用于熒光檢測(cè)。

　　BioRad酶標(biāo)儀概述；

　　室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學(xué)能、電能或熱能）后躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，以光的形式放出能量，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光現(xiàn)象"。分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光等。受到光照時(shí)發(fā)光，光照切斷時(shí)發(fā)光立即消失的叫熒光，光照切斷時(shí)，發(fā)光逐漸變?nèi)跻灾孪У慕辛坠猓栈瘜W(xué)反應(yīng)的化學(xué)能量而發(fā)光叫化學(xué)發(fā)光，由生物能轉(zhuǎn)變?yōu)楣廨椛涞姆Q作生物發(fā)光。

　　由于發(fā)光物質(zhì)不同熒光有分子熒光和原子熒光之分，分子熒光為帶光譜，原子熒光為線光譜，通常所說(shuō)的熒光為分子熒光。通過(guò)測(cè)定所發(fā)射熒光的特性和強(qiáng)度，可以對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析。

　　BioRad酶標(biāo)儀熒光檢測(cè)技術(shù)；

　　1熒光強(qiáng)度

　　熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，這是熒光分析法是量分析的依據(jù)。在生物學(xué)上的應(yīng)用非常廣泛，可以進(jìn)行生物大分子定量，酶活性分析，熒光免疫分析，細(xì)胞學(xué)分析（細(xì)胞增殖，細(xì)胞毒理，細(xì)胞吸附等）和分子間相互作用。

　　1.1細(xì)胞凋亡檢測(cè)

　　Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小 亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，*終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3的活性明顯下降。

　　設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Z-DEVD-AMC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光，短肽被水解后釋放出AMC，自由的AMC才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定 caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。

　　1.2細(xì)胞毒性的檢測(cè)

　　體外細(xì)胞毒性研究對(duì)于檢測(cè)新的生物來(lái)源或人工合成的細(xì)胞毒素以及例行的臨床相關(guān)的檢測(cè)都有著重要的意義。非滲透性的核染料 Propidium iodide能穿透損傷的，熒光密度越高反映出其受損細(xì)胞越多。

　　1.3鈣流檢測(cè)

　　Fura-2、indo-1、Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，當(dāng)結(jié)合鈣離子時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生改變，發(fā)射熒光的強(qiáng)度和結(jié)合的Ca2+濃度有著定量的關(guān)系。

　　2.熒光偏振(FP)

　　1926年P(guān)errin首先描述了熒光偏振理論，溶液中的熒光分子在受到偏振光照射時(shí)，可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光，如果在激發(fā)時(shí)熒光物質(zhì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，發(fā)射光將保持原有激發(fā)光的偏振性，如果其處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，發(fā)射光電偏振偏振平面將不同于原有激發(fā)光的偏振特性，這就是熒光偏振現(xiàn)象，熒光分子與其它因子的相互作用，例如相互結(jié)合或排斥；其所處環(huán)境的性質(zhì)，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對(duì)這個(gè)熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的發(fā)射光的發(fā)射平面產(chǎn)生影響。因此以熒光偏振為基礎(chǔ)發(fā)展的技術(shù)可用來(lái)研究生命科學(xué)中分子之間的相互作用，如受體配體結(jié)合分析，DNA－蛋白質(zhì)結(jié)合分析，SNP分析，酶活性分析。

　　熒光偏振分析所需的樣品量少，靈敏度高，可達(dá)亞納摩爾級(jí)范圍，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，也更為安全可靠，不會(huì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生成有害的放射性，此外熒光偏振是真正均相的，允許實(shí)時(shí)檢測(cè)（動(dòng)力學(xué)檢測(cè)），對(duì)于濃度變化不敏感，是均相檢測(cè)形式（中間不含洗滌步驟）的解決方案。

　　BioRad服務(wù)承諾：按照維修程序及操作規(guī)程維修，確保維修質(zhì)量。

　　1.嚴(yán)把配件質(zhì)量關(guān)，杜絕偽劣配件以舊配件的使用。

　　2.服務(wù)熱線24小時(shí)有人值班，24小時(shí)內(nèi)出回應(yīng)。維修車間及前臺(tái)接待節(jié)日不休息，保用戶隨到隨修建立維修制度及時(shí)成立搶修小組，可隨時(shí)到達(dá)現(xiàn)場(chǎng)搶修。

　　3.收費(fèi)方面嚴(yán)格執(zhí)行市物價(jià)局和我公司收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)，不夸大故障，杜絕亂收費(fèi)。

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　　5.經(jīng)我維修的電器一律實(shí)行保修，在保修期內(nèi)如因維修質(zhì)量或更換配件質(zhì)量出現(xiàn)問(wèn)題，我負(fù)責(zé)返修。

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