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食品微生物檢測(cè)中菌落總數(shù)測(cè)定
菌落總數(shù)主要是作為判定食品被細(xì)菌污染程度的標(biāo)記，也可以應(yīng)用這一方法觀察食一中細(xì)菌的性質(zhì)以及細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供科學(xué)依據(jù)。
菌落總數(shù)測(cè)定的幾項(xiàng)說(shuō)明
1．菌落總數(shù)的測(cè)定：
是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)瓊脂或者平板計(jì)數(shù)瓊脂或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（根據(jù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)要求選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基）混合后，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞都能形成一個(gè)可見(jiàn)的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗(yàn)中采用37℃于有氧條件下培養(yǎng)(空氣中含氧約20％)，因而并不能測(cè)出每g或mL檢樣中實(shí)際的總活菌數(shù)，厭氧菌、微嗜氧菌和冷營(yíng)菌在此條件下不生長(zhǎng)，有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制，因此所得結(jié)果，只包括一群能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂中發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。
2．鑒于檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)，成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在菌落總數(shù)測(cè)定培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的菌落可以來(lái)源于細(xì)胞塊，也可以來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞，因此平板上所得需氧和兼性厭氧菌菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容量或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位數(shù)(colony forming units，CFU)報(bào)告之。
3．每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)用不同的營(yíng)養(yǎng)條件及其他生理?xiàng)l件(如溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等)去滿足其要求，才能分別將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來(lái)。因此，要得到較全面的細(xì)菌菌落總數(shù)，應(yīng)將檢樣接種到幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)在不同條件下，如溫度，氧氣供應(yīng)等。
菌落總數(shù)的測(cè)定
在食品微生物檢測(cè)中測(cè)定菌落總數(shù)時(shí)，是將食品檢樣做成幾個(gè)不同的10倍遞增稀釋液，然后從各個(gè)稀釋液中分別取出一定量在平皿內(nèi)與菌落總數(shù)測(cè)定培養(yǎng)基相混合，經(jīng)培養(yǎng)后，按一定要求計(jì)算出皿內(nèi)瓊脂平板上所生成的細(xì)菌集落數(shù)，并再根據(jù)檢樣的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出每g或mL樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。
菌落總數(shù)測(cè)定中的一些要求和規(guī)定
為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，檢驗(yàn)時(shí)必須遵循以下一些要求和規(guī)定：
(一)所用器皿及稀釋液：
1. 檢驗(yàn)中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是*滅菌的，并在滅菌前*洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。
2. 用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對(duì)照。如果在瓊脂對(duì)照平板上出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要追加對(duì)照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
3. 檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用，不會(huì)因?yàn)樵谙♂屵^(guò)程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對(duì)含鹽量較高的食品(如，醬品等)進(jìn)行稀釋，則宣采用蒸餾水。
(二)檢樣稀釋：
1. 檢樣稀釋時(shí)，應(yīng)以無(wú)菌手續(xù)稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或mL)剪碎放于含有225ml滅菌稀釋液的玻璃瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖作成l：10的稀釋液。如系肉、魚(yú)等固體樣品，剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻，或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯中，以8000～10000rpm速度攪拌1分鐘，使做成均勻的1：10稀釋液。
2. 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個(gè)適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1：10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成l：100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1：1000、1：10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另?yè)Q1支l mL滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。
3. 從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時(shí)，不要將吸管碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時(shí)，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因?yàn)檫@些部分都可能接觸過(guò)手或其他沾污物。
4. 在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液砸2.5cm；吸入液體時(shí)，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管離開(kāi)液面，將貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度，這樣取樣較準(zhǔn)確，而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時(shí)不會(huì)有多余的液體粘附于管外。
5. 當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時(shí)，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。
(三)平板接種與培養(yǎng)：
1. 將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時(shí)，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(nèi)(從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋)，后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個(gè)稀釋度應(yīng)作2個(gè)平皿。
2. 用于傾注平皿的營(yíng)養(yǎng)瓊脂應(yīng)預(yù)先加熱使融化，并保溫于45±1℃恒溫水浴鍋中待用。傾注平皿時(shí)，每皿內(nèi)傾入約15mL，后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。
3. 為了防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應(yīng)在20分鐘內(nèi)向皿內(nèi)傾入瓊脂，并立即使其與瓊脂混和均勻。
4. 檢樣與瓊脂混和時(shí)，可將皿底在平面上先向一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反的方向旋轉(zhuǎn)，以使充分混勻。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)加小心，不要使混和物濺到皿邊的上方。為了保證混和均勻，而不濺及皿邊的上方，直接將加有檢樣的平皿放在旋轉(zhuǎn)儀上(可同時(shí)放4只平皿)，加入瓊脂后，開(kāi)動(dòng)電鈕，在數(shù)十秒鐘內(nèi)即可自動(dòng)左右旋轉(zhuǎn)而使皿內(nèi)的檢樣與瓊脂混合均勻。
5. 皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長(zhǎng)久放置，然后始翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，而應(yīng)于瓊脂凝固后，在數(shù)分鐘內(nèi)即應(yīng)將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長(zhǎng)。必要時(shí)，可先將皿打開(kāi)倒置(皿底向上)于電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)經(jīng)15~60分鐘使瓊脂表面干燥后，再將皿底移至蓋內(nèi)倒置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。這樣可以阻止運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴(kuò)展生長(zhǎng)。
6. 為了控制污染，在取樣進(jìn)行檢驗(yàn)的同時(shí)，于工作臺(tái)上打開(kāi)一塊瓊脂平板，其暴露的時(shí)間，應(yīng)與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時(shí)所暴露的長(zhǎng)的時(shí)間相當(dāng)，然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過(guò)程中有無(wú)受到來(lái)自空氣的污染。
7. 培養(yǎng)溫度：
應(yīng)根據(jù)食品種類(lèi)而定。肉、乳、蛋類(lèi)食品用37℃培養(yǎng)，水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為48±2小時(shí)。其他食品，如，清涼飲料，調(diào)味品，糖果、糕點(diǎn)．果脯，酒類(lèi)(主要為發(fā)酵酒)、豆制品和醬腌萊均系用電熱恒溫培養(yǎng)箱37℃24±2小時(shí)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時(shí)間之所以有這種不同的區(qū)分，乃是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時(shí)，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時(shí)間所取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來(lái)自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。
(四)對(duì)照試驗(yàn)：
1. 加入平皿內(nèi)的檢樣稀釋液(特別是10：1的稀釋液)，有肘帶有食品顆粒，在這種情況下，為了避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境巾放置，以便在計(jì)數(shù)撿樣菌落時(shí)用作對(duì)照。
2. 為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆，也可在已溶化而保溫于45℃水浴內(nèi)的瓊脂中，按每100ml加lmL，0.5％氯化三苯四氮唑(2，3，5triphenyltetrazolium chloride，TTC)水溶液之量加入適量的TTC。培養(yǎng)后，如是食品顆粒，不見(jiàn)變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落，配好的TTC溶液，應(yīng)先用來(lái)與不加TTC的作對(duì)照，以觀察其對(duì)計(jì)數(shù)是否有不利的作用(TTC在一定濃度下對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用)。TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。無(wú)色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后，在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏(formazan)，使菌落呈現(xiàn)紅色。
(五)菌落計(jì)數(shù)：
1. 從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個(gè)平皿和不同稀釋度的幾個(gè)平皿內(nèi)平板上菌落生長(zhǎng)情況。平行試驗(yàn)的2個(gè)平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近，不同稀釋度的幾個(gè)平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比，即檢樣稀釋倍數(shù)越大，菌落數(shù)越低，稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越高。
2. 計(jì)數(shù)菌落時(shí)，應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。1個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)；如其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。如在一個(gè)稀釋度的兩個(gè)平板中，一個(gè)平板的菌落數(shù)在30～300之間，另一個(gè)大于300或小于30時(shí)，則以菌落數(shù)在30～300間的平板作為計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。
3. 注意事項(xiàng)
(1)如果稀釋度大的平板上菌落數(shù)反比稀釋度小的平板上菌落數(shù)高，則系檢驗(yàn)工作中發(fā)生的差錯(cuò)，屬實(shí)驗(yàn)室事故。此外，也可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計(jì)數(shù)報(bào)告的依據(jù)。
(2)如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，菌落之間沒(méi)有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時(shí)，一個(gè)細(xì)菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)，如有來(lái)源不同的幾條鏈，每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)，不要把鏈上生長(zhǎng)的各個(gè)菌落分開(kāi)來(lái)數(shù)。此外，如皿內(nèi)瓊脂凝固后未及時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)而遭受昆蟲(chóng)侵入，在昆蟲(chóng)爬過(guò)的地方也會(huì)出現(xiàn)鏈狀菌落，也不應(yīng)分開(kāi)來(lái)數(shù)。
(3)如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可計(jì)作報(bào)告，而應(yīng)在稀釋度大的平板上，任意數(shù)其中2cm2個(gè)，除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)乘以皿底面積63.6cm2數(shù)，再乘其稀釋倍數(shù)作報(bào)告。例如10-1～10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布，而在lO-3稀釋的平板上任數(shù)2個(gè)cm2。內(nèi)的菌落數(shù)是60個(gè)，皿底直徑為9cm，則該檢樣每g(或m1)中“估計(jì)”菌落數(shù)為：60／2×63．6×1000=1908000或1.9×106。
63.6cm2數(shù)系按皿底直徑為9cm時(shí)計(jì)算而得，即：(9／2)2×3．14=63．6；如所用平皿的皿底直徑不是9cm，則可按其直徑的實(shí)際cm數(shù)代人圓面積公式求出。
(4)菌落計(jì)數(shù)中燈光由側(cè)面射向平板，菌落易于觀察。由于儀器帶有電子音響訊號(hào)，用特制金屬探筆點(diǎn)數(shù)中，在發(fā)出音響之下始顯示數(shù)字增加，不會(huì)發(fā)生差錯(cuò)。且燈光與平板之間夾有多用方格玻質(zhì)規(guī)板(方格面積為lcm2)，也有助于對(duì)菌落密布的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
(5)檢樣如系微生物類(lèi)制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料)，則平板計(jì)數(shù)中應(yīng)相應(yīng)地將有關(guān)微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除，不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報(bào)告。一般在校正檢樣的pH7．6后，再進(jìn)行稀釋和培養(yǎng)，此類(lèi)嗜酸性微生物往往即不易生長(zhǎng)。并可用革蘭氏法染色鑒別。染色鑒別時(shí)，要用不校正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養(yǎng)所生成的菌落涂片染色作對(duì)照，以資辨別。酵母菌卵圓形，遠(yuǎn)比細(xì)菌大，大小為2～5×5～30μm，革蘭氏陽(yáng)性著色。乳酸桿菌在24小時(shí)內(nèi)，于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上在有氧條件下培養(yǎng)，通常是不生長(zhǎng)的。
(六)報(bào)告方式
1. 菌落數(shù)小于100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU 時(shí),第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù),則報(bào)告菌落蔓延。若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng),則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
2. 檢樣為固體，用重量法取樣檢驗(yàn)時(shí)，以g為單位報(bào)告其菌落數(shù)；檢樣為液體，用容量法取樣檢驗(yàn)時(shí)，以mL為單位報(bào)告其菌落數(shù)；如檢樣為樣品表面的涂擦液，則應(yīng)以cm2為單位報(bào)告其菌落數(shù)。
3. 如檢樣為液體，在兩個(gè)平皿內(nèi)所加lmL未經(jīng)稀釋的檢樣(原液)培養(yǎng)中，均無(wú)細(xì)菌集落生成，則報(bào)告為lmL檢樣內(nèi)未有菌落生長(zhǎng)，或1mL檢樣內(nèi)菌落數(shù)<1。
特殊的方法
(一)平板表面涂布法
將營(yíng)養(yǎng)瓊脂制成平板，經(jīng)50℃，l－2小時(shí)或35℃，18－20小時(shí)干燥后，于其上滴加檢樣稀釋液0.2mL，用L捧涂布于整個(gè)平板的表面，放置片刻(約10分鐘)，將平板翻轉(zhuǎn)，移至36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時(shí)(水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)48±2小時(shí))，取出，按前述方式進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，然后乘以5(由0.2mL換算為1mL)，再乘以樣品稀釋的倍數(shù)，即得每g或mL檢樣所含菌落數(shù)。
此法較上述傾注法為優(yōu)，因菌落生長(zhǎng)在表面，便于識(shí)別和檢查其形態(tài)，雖檢樣中帶有食品顆粒也不會(huì)發(fā)生混淆，同時(shí)還可使細(xì)菌不必遭受融化瓊脂的熱力，不致因此而使菌細(xì)胞受到損傷而不生長(zhǎng)，從而可避免由于檢驗(yàn)操作中的不良因素而使檢樣中細(xì)菌菌落數(shù)降低。但是本法取樣量較傾注法為少(僅傾注法的五分之一)，代表性將受到一定的影響。
(二)平板表面點(diǎn)滴法
與涂布法相似，所不同者，只是用標(biāo)定好的微量吸管或注射器針頭按滴（使每滴相當(dāng)于0.025mi）將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區(qū)域（預(yù)先在平板背面用標(biāo)記筆劃成四個(gè)區(qū)域），每個(gè)區(qū)域滴1滴，每個(gè)稀釋度滴兩個(gè)區(qū)域，作為平行試驗(yàn)。滴加后，將平板放平片刻（約5～10分鐘），然后翻轉(zhuǎn)平板，如前移入電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6～8小時(shí)后進(jìn)行計(jì)數(shù)，將所得菌落數(shù)乘以40（由0.025mL換算為1mL），再乘以樣品稀釋的倍數(shù)，即得每g或mL檢樣所含菌落數(shù)。